Целью исследования стало изучение ассоциации комбинаций полиморфных участков гена VEGF и генов цитокинов (IL1В, IL4, IL6, IL10 и TNFА) с СД2 у женщин. Для исследования отобраны точки полиморфизма, ассоциированные с высокими или низкими уровнями продукции и сывороточной концентрации кодируемых этими генами регуляторных макромолекул.

В исследование включена группа из 586 жителей России женского пола, считающих себя и своих родителей русскими, в том числе 374 женщины без нарушений углеводного обмена, в возрасте от 23 до 68 лет, и 212 пациенток с СД2 в возрасте от 28 до 69 лет. Диагноз СД устанавливался по критериям ВОЗ (1999 г.). У больных с верифицированным СД определялась гликемия натощак и после еды, а также уровень гликированного гемоглобина А1с. При необходимости проводилось исследование С-пептида, антител к глутаматдекарбоксилазе и антиостровковых антител, для исключения латентного аутоиммунного диабета взрослых. В исследование не включались пациенты с эндокринопатиями, болезнями экзокринной части поджелудочной железы и другими факторами риска симптоматических форм СД. 

Обследованные давали письменное информированное согласие на участие в исследовании. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом. 

Исследован однонуклеотидный полиморфизм нетранслируемых регионов генов: VEGF А-2578С и С+936Т, IL1В С-31Т, IL4 С-590Т, IL6 G-174C, IL10 A-592C и А-1082G, TNFА А-238G, A-308G и A-863C. Генотипирование осуществляли методом рестриктного анализа продуктов амплификации. Участки промоторного региона генов амплифицировали с использованием пары специфичных праймеров, затем продукты амплификации подвергали гидролизу соответствующими эндонуклеазами рестрикции («СибЭнзим», Новосибирск). Электрофорез проводили в 2% агарозном геле [22, 23]. 

При статистическом анализе результатов использовали такие показатели, как частота встречаемости генов, генотипов и их комбинаций, специфичность (Sp – вероятность отрицательного результата генетического теста при отсутствии заболевания), отношение шансов (odds ratio – отношение шансов события в одной группе к шансам этого же события в другой группе), с расчетом 95% доверительного интервала (95% CI). Частоту аллелей генов цитокинов вычисляли методом прямого подсчета по формуле: f=n/2N, где n – количество раз встречаемости аллеля (у гомозигот он учитывался дважды), 2N – удвоенная численность обследованных. Частоту встречаемости отдельных генотипов и их комбинаций определяли как процентное отношение индивидов, несущих генотип (комбинацию генотипов), к общему числу обследованных в группе по формуле: f=n/N, где n – количество раз встречаемости генотипа (комбинации), N – численность обследованных. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга [24]. Достоверность различий частот распределения изучаемых признаков в альтернативных группах определяли по критерию χ2 с поправкой Йетса на непрерывность и двустороннему варианту точного метода Фишера для четырехпольных таблиц [25].

Анализ распределения отдельных аллелей гена VEGF в точках полиморфизма А-2578С и С+936Т в нашей выборке европеоидов России не выявил существенных различий в зависимости от наличия СД2. Характер распределения всех генотипов соответствовал распределению Харди-Вайнберга. Установлено лишь незначительное увеличение частоты встречаемости аллеля А с соответствующим снижением частоты аллеля С в точке полиморфизма -2578 среди пациентов с СД2 (OR=1,3, CI95%: 1,01–1,6, р=0,0485). Частоты генотипов достоверно не различались и при исследовании комбинаций обоих полиморфизмов. Ранее сообщалось об отсутствии ассоциаций аллелей и генотипов VEGF с СД2 [26].

Гораздо более выраженные различия между группами здоровых и больных СД2 обнаружены при анализе распределения комбинированных генетических признаков, в состав которых входят генотипы одного или обоих полиморфизмов гена VEGF. Комплексный анализ частот встречаемости генотипов VEGF в точках полиморфизма А-2578С и С+936Т в сочетании с вариантами генов IL1B С-31Т, IL4 С-590Т, IL6 G-174C, IL10 A-592C и А-1082G, а также TNFA G-238C, A-308G и A-863C, выявил 579 комбинированных генетических признаков, частота которых оказалась различна в группах здоровых и больных СД2 с уровнем достоверности различий по двустороннему критерию Фишера р<0,05. В целях повышения информативности анализируемых признаков и приближения расчетных популяционных показателей к результатам, которые могут использоваться в персонализированной медицине, далее был проведен анализ встречаемости комбинированных генетических признаков со значимостью различий p<0,002 (табл. 1, 2). Данному уровню достоверности соответствовали 52 признака: частота 34 из них была повышена среди пациентов с СД2, частота 18 признаков, напротив, оказалась пониженной. 

Среди всех позитивно ассоциированных с СД2 комбинированных генетических признаков обращает внимание высокая частота встречаемости гомозиготных вариантов генотипов VEGF в обеих точках полиморфизма (табл. 1). Их общая доля среди всех признаков, ассоциированных с СД2, составила 70,6%, тогда как среди здоровых лиц преобладали гетерозиготные варианты. Среди гомозиготных вариантов гена VEGF в большинстве случаев (83,3%) выявлены варианты СС в обеих точках полиморфизма, ассоциированные с повышенным уровнем продукции фактора [9]. 

Среди генов цитокинов, которые совместно с вариантами генов VEGF вошли в состав позитивно ассоциированных с СД2 комбинированных генетических признаков, обращает на себя внимание чрезвычайно высокая доля гомозиготных вариантов АА в точке -1082 и СС в точке -592 гена IL10. Эти варианты выявлялись в составе подавляющего большинства генетических комбинаций (94,1% случаев). Указанные генотипы ассоциированы с высоким уровнем продукции IL-10 – цитокина с противовоспалительными и антиангиогенными свойствами. Таким образом, в генотипе женщин с СД2 одновременно присутствуют варианты генов, способствующие высокой продукции проангиогенного/провоспалительного и антиангиогенного/противовоспалительного фактора (VEGF и IL-10). Такие комбинации не характерны для регуляции воспаления и ангиогенеза в норме: у обследованных нами 374 женщин без СД2 они встречались крайне редко. 

О наличии генетических особенностей регуляции ангиогенеза и воспалительного ответа у пациентов с СД2 свидетельствуют и результаты анализа полиморфизма генов других цитокинов. В составе ассоциированных с СД2 генетических комбинаций в позиции -590 гена IL4 выявлялся исключительно гомозиготный вариант СС. Данный вариант ассоциирован с низким уровнем продукции IL-4 – противовоспалительного цитокина, обладающего выраженной способностью ингибировать ангиогенез [27]. В большей части генетических комбинаций обнаружены гомозиготные варианты GG или СС в полиморфных позициях регуляторных участков А-238G, А-308G и А-863C гена TNFA, которые ассоциируются с низким уровнем продукции фактора. Известно, что ангиотропное действие TNF-α обладает дозозависимым эффектом – в низких дозах проявляется проангиогенное влияние, в высоких дозах оно сменяется на антиангиогенное [28]. Практически во всех случаях в составе комбинаций у больных СД2 встречался гомозиготный вариант GG в позиции -174 гена IL6, ассоциированный с высоким уровнем продукции цитокина. Известно, что IL-6 обладает выраженной провоспалительной активностью, а также способен стимулировать ангиогенез путем активации продукции VEGF [29]. Полученные данные согласуются с результатами других исследований, показавших ассоциацию аллели G в позиции -174 гена IL6 c развитием СД2 [13, 14].

В составе комбинированных генетических признаков, негативно ассоциированных с СД2, гомозиготные варианты гена VEGF встречались в равном соотношении с гетерозиготными генотипами (табл. 2). То же можно отнести к соотношению числа гомо- и гетерозиготных вариантов гена IL10. Среди генотипов IL4 и IL6 преобладали гетерозиготные варианты. Частота аллельных вариантов гена TNFA в составе комбинаций, позитивно и негативно ассоциированных с СД2, достоверно не различалась; в обеих группах преобладали варианты, связанные с низким уровнем продукции фактора. Существенным отличием группы генетических признаков, негативно ассоциированных с СД2, от группы позитивно ассоциированных признаков, оказалось наличие значительного числа гетерозиготных вариантов гена IL1B в позиции -31 C/T. Молекула IL-1β, синтез которой кодируется этим геном, обладает выраженным провоспалительным и проангиогенным действием [30].

Представленные данные свидетельствуют о сущест­венных различиях частот встречаемости комбинаций генотипов VEGF и других цитокинов, регулирующих интенсивность воспалительного ответа и ангиогенез, между больными СД2 и здоровыми женщинами. Выделенные комбинации в целом ряде случаев полностью отсутствуют у здоровых женщин и широко распространены среди женщин больных СД2. Высокая степень достоверности различий частот генетических комбинаций у больных и в контроле приближает их по информативности к так называемым «биологическим или генетическим маркерам» предрасположенности или резистентности к развитию СД2, что делает их использование перспективным в медицинской практике.

Комбинации аллельных вариантов гена VEGF в точках полиморфизма A-2578С и C+936Т с генотипами IL1B C-31Т, IL4 С-590Т, IL6 G-174C, IL10 А-592C и А-1082G, TNFA A-238G, A-308G и A-863C могут служить генетическими маркерами высокого и низкого риска развития СД2 у женщин европеоидного происхождения. В составе генетических комбинаций, ассоциированных с СД2, присутствует большое число гомозиготных вариантов генов цитокинов, влияющих на уровень экспрессии их продуктов и, тем самым, определяющих особенности течения воспалительных процессов и состояние ангиогенеза. Это свидетельствует о необходимости комплексного изуче­­ния роли семейства цитокинов и ростовых факторов с проангиогенной и провоспалительной активностью в патогенезе развития и характера течения СД2, с акцентом на молекулярно-генетические механизмы контроля базового уровня продукции регуляторных факторов в организме каждого индивида. Такой подход позволяет использовать полученные индивидуальные характеристики в обосновании персонализированных подходов в диабетологии.

Авторы декларируют отсутствие двойственности (конфликта) интересов, связанных с рукописью.