Обследовали 63 больных СД 1 (22 мужчин и 41 женщину, в возрасте 16–54 лет (29,0±9,7 лет)) при длительности заболевания от 1 мес до 34 лет (8,5±8,0 лет). В исследование не включались больные с кетоацидозом, патологией почек недиабетического генеза, с обострением сопутствующих заболеваний. Иссле­довали суточную протеинурию, альбуминурию, мочевой осадок, креатинин крови с расчетом скорости клубочковой фильтрации (СКФ) по Cockcroft-Gault, УЗИ почек, проводили cуточное мониторирование артериального давления (СМАД). Нормальная экскреция альбумина с мочой (ЭАМ) выявлена у 23 обследованных (1-я группа), у 29 зафиксирована микроальбуминурия (2-я группа), у 11 – протеинурия (3-я группа). Нару­шение клиренса креатинина имело место у 7 больных 3-й группы. Клинико-лабораторная характеристика групп представлена в таблице 1. Пациенты с выраженной нефропатией в целом были несколько старше, имели большую длительность СД, более высокие показатели гликемии натощак, протеинурии, креатинина, меньшую СКФ и более высокие показатели АД по сравнению с больными других групп.

Определение концентрации sICAM-1 в сыворотке крови осуществляли методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческих наборов Bendek Medsystems, Biosource (Бельгия) с использованием планшеточного ридера «BioRad 680» (BioRad, США) и программного обеспечения Zemfira. Исследования выполнены в гормональной лаборатории ООО «Лабораторная диагностика» (зав. лабораторией – к.м.н. В.В. Романов). Результаты определения sICAM-1 сравнивали с контрольной группой, в которую вошли 10 здоровых лиц (7 мужчин и 3 женщины) 18–44 лет (средний возраст 28,8±9,5 лет).

Типирование ICAM-1 в биоптатах почек проведено у 15 пациентов (5 мужчин и 10 женщин в возрасте 16–41 года, с длительностью СД от 3 мес до 12 лет (в среднем 4,1±3,3 лет). ЭАМ у трех обследованных находилась в диапазоне нормальных значений, у восьми – в диапазоне микроальбуминурии, у одной пациентки выявлена протеинурия (0,8 г/сут). Все больные имели нормальный клиренс креатинина (СКФ от 62,6 до 130,6 мл/мин). Пункционная нефробиопсия выполнялась для оценки выраженности и характера поражения почек при наличии одного или нескольких факторов риска ДН: большая длительность СД, микроальбуминурия, диабетическая ретинопатия и/или артериальная гипертензия. Процедура выполнялась под контролем УЗИ в отделении ультразвуковой диагностики (зав. – А.В. Сасин) Новосибирской Государственной областной клинической больницы. Пациенты давали письменное информированное согласие на проведение биопсии.

Локализацию ICAM-1 в почечных структурах исследовали методом иммуногистохимического типирования c помощью моноклональных антител к CD54 фирмы «Novocastra Laboratories Ltd» (Великобритания). Выраженность иммуногистохимической реакции оценивали полуколичественно. В качестве контроля использовали почки 15 здоровых лиц (5 мужчин и 5 женщин), 25–42 года (средний возраст 33,2±8,1 лет), погибших от черепно-мозговых травм (автокатастрофы). При судебно-медицинском исследовании этих лиц не выявлено признаков хронических заболеваний, отравлений, травматических и иных повреждений почек. Образцы почек забирали не позднее 24 ч от момента биологической смерти.

Протокол исследования одобрен этическим комитетом Новосибирского государственного медицинского университета (протокол заседания № 1/11 от 16.11. 2005 г.).

Статистическая обработка проведена с использованием пакета STATISTICA 6.0. Использованы дисперсионный анализ, корреляционный анализ, многофакторный регрессионный пошаговый анализ. Для оценки межгрупповых различий применяли t-критерий Стьюдента (для двух независимых групп) или ANOVA (для трех или более групп). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05. Данные представлены как средние и стандартные отклонения (M±SD).

Уровень sICAM-1 в крови у больных СД составил 347,2±126,1 нг/мл (153–812 нг/мл), в контрольной группе – 268,3±63,2 нг/мл (170–375 нг/мл). Средний уровень sICAM-1 у больных оказался значимо выше контроля (р=0,02).

Зависимость уровня sICAM-1 от стадии ДН представлена на рис. 1. У пациентов с нормоальбуминурией содержание sICAM-1 практически не отличалось от такового у здоровых лиц (р=0,20). У больных с микроальбуминурией зафиксирована тенденция к повышению уровня молекулы адгезии, хотя и не достигшая степени статической значимости (р=0,07). Достоверное повышение уровня sICAM-1 имело место у больных с протеинурией (р=0,003).

Больные с артериальной гипертензией имели более высокие значения sICAM-1 по сравнению с остальными пациентами (379,8±129,2 и 319,4±118,2 нг/мл соответственно, р=0,04). Содержание sICAM-1 положительно коррелировало с величиной среднесуточного диастолического АД, с индексом времени диастолической артериальной гипертензии (r=0,39; div=0,04 и r=0,38; div=0,05 соответственно), но не с параметрами систолического АД.

Высокий уровень sICAM-1 был характерен для больных с ранним развитием и быстрым прогрессированием нефро- и ретинопатии (371,4±156,3 нг/мл, n=21, р=0,05). Нормальное содержание молекулы адгезии выявлено при медленном развитии микроангиопатий (263,2±64,1 нг/мл). Наличие сопутствующей патологии не оказало влияния на уровень sICAM-1. Не отмечено различий в уровне sICAM-1 в зависимости от курения и особенностей терапии.

При изучении связи между уровнем sICAM-1 и качеством контроля гликемии наименьшие значения sICAM-1 выявлены у пациентов с хорошо компенсированным СД (303,6±100,7 нг/мл, n=14; отличия от контроля незначительны: р=0,35). Если целевой уровень гликемии не был достигнут, то содержание sICAM-1 значимо превышало контроль (355,8±132,6 нг/мл, n=41, р=0,05). Наибольшие уровни sICAM-1 зафиксированы у больных с лабильным диабетом, резкими колебаниями гликемии в течение суток (387,3±123,3 нг/мл, n=8, р=0,02). Уровень sICAM-1 положительно коррелировал с концентрацией глюкозы натощак (r=0,30; р=0,02) и с постпрандиальной гликемией (r=0,34; р=0,007).

Не установлено значимых корреляций между содержанием sICAM-1 и возрастом больных (r=0,16; р=0,01), длительностью СД (r=–0,09; р=0,01), суточной дозой инсулина (r=0,02; р=0,01), уровнем фибриногена (r=–0,02; р=0,01), лейкоцитов (r=0,20; р=0,01) и СОЭ (r=0,21; р=0,01).

При исследовании биоптатов почек выявлены изменения, свойственные начальным стадиям ДН: гипертрофия и гиперклеточность клубочков, очаговое расширение мезангия, расширение просвета и утолщение стенок капиллярных петель, сужение просвета капсулы, утолщение ее париетального листка, дистрофические и атрофические изменения эпителия канальцев, начальные этапы склероза интерстиция и артериол. У двух больных выявлено полное замещение отдельных клубочков соединительной тканью. Объемная доля мезан­гия (соотношение мезангий/клубочек) составила в среднем 22,8±4,8% (13,1–30,8%).

Иммуногистохимическое исследование с помощью антител к CD54 не выявило положительной реакции на ICAM-1 в препаратах почек контрольной группы. Присутствие ICAM-1 в клубочках обнаружено у 7 из 15 больных СД. Реакция во всех случаях была слабоположительной, ICAM-1 выявлялись в отдельных клубочках на периферии капиллярных петель. Наиболее часто присутствие ICAM-1 обнаруживалось в канальцах: в 8 случаях реакция оказалась положительной (отчетливое окрашивание всех канальцев в препарате), в 5 случаях – слабоположительной (частичное окрашивание отдельных канальцев) и только в 2 случаях – отрицательной. Пример положительной иммуногистохимической реакции на ICAM-1 в клубочке и канальцах почки у больного с СД представлен на рис. 2.

Большинство пациентов с положительной реакцией на ICAM-1 имели повышенную ЭАМ: у 4 выявлена микроальбуминурия, у 1 – протеинурия; нормоальбуминурия сохранялась у 2 обследованных. Среди пациентов с отрицательной реакцией на ICAM-1 нормальная ЭАМ зафиксирована у 5 пациентов, микроальбуминурия – у 3. Различий по фильтрационной функции почки между выделенными подгруппами не найдено (табл. 2). Больные с положительной реакцией на ICAM-1 в клубочках имели более высокие цифры мониторного систолического и диастолического АД и более высокий индекс времени диастолической гипертензии. Кроме того, у этих больных зарегистрированы более высокие показатели гликемии натощак. Не выявлено какой-либо взаимосвязи между наличием ICAM-1 и возрастом больных, дозой инсулина, длительностью СД. Обращает на себя внимание возможность появления ICAM-1 в клубочках при небольшой длительности заболевания (в наших наблюдениях наименьший срок от манифестации СД составлял 7 мес). Прослеживалась тенденция к увеличению объема мезангия у больных с положительной реакцией на молекулы адгезии в клубочках в сравнении с остальными пациентами (24,4±2,3 и 20,9±6,5 соответственно, р=0,2).

При сопоставлении уровня ICAM-1 в почках с концентрацией растворимой формы этих молекул в сыворотке крови оказалось, что больные с положительной реакцией на ICAM-1 в клубочках имели достоверно более высокий уровень циркулирующих молекул адгезии по сравнению с пациентами с отрицательной иммуногистохимической реакцией (391,6±96,7 и 266,6±63,3, р=0,02).

Положительная реакция на ICAM-1 в канальцах, зафиксированная у большинства обследованных пациентов, наблюдалась при длительности СД от 7 мес до 12 лет. Взаимосвязи выраженности реакции в канальцах с возрастом больных, дозой инсулина, уровнем АД, креатинина, СКФ не установлено. Микроальбуминурия на нижней границе диапазона (31,6 мг/сут) выявлена у одной больной с отрицательной реакцией на ICAM-1. Четыре пациента со слабоположительной реакцией на ICAM-1 имели нормальную ЭАМ, у 1 выявлена микроальбуминурия. Среди пациентов с положительной реакцией нормальная ЭАМ зафиксирована у 2, микроальбуминурия – у 5, протеинурия – у 1. Уровень гликемии натощак у больных с положительной реакцией на ICAM-1 оказался выше, чем у пациентов со слабоположительной реакцией (10,8±2,4 и 7,0±3,3 ммоль/л, р=0,05). Гликемия после еды показала аналогичную тенденцию (9,3±2,9 и 7,3±1,4 ммоль/л, р=0,13).

Прослеживался очевидный параллелизм в изменении уровня ICAM-1 в клубочках и канальцах. У пациентов с отрицательной и слабоположительной реакцией на ICAM-1 в канальцах, за исключением одного случая, ICAM-1 в клубочках не выявлялись. Напротив, у 6 из 8 пациентов с положительной реакцией на ICAM-1 в канальцах данные молекулы выявлялись и в клубочках.

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что развитие ДН у больных СД 1 сопровождается заметным увеличением содержания растворимой формы sICAM-1 в сыворотке крови и усилением синтеза ICAM-1 в клубочках и канальцах почек.

Известно, что sICAM-1 появляются в сыворотке в результате протеолиза и слущивания с ICAM-1-позитивных клеток. Ранее в экспериментах показано возрастание синтеза ICAM-1 в эндотелии при воздействии высокого уровня глюкозы [16, 17]. В работе М.В. Шестаковой и соавт. [18] показано увеличение экспрессии ICAM-1 на гранулоцитах и лимфоцитах крови у больных СД 1, имеющих протеинурию. Можно предположить, что источниками избыточного количества циркулирующих sICAM-1 у больных СД являются клетки сосудистого эндотелия и лейкоциты крови.

Основным фактором, определяющим повышение sICAM-1 в кровотоке, оказался уровень гликемии. Ранее было показано, что улучшение контроля гликемии на фоне интенсивной инсулинотерапии у больных СД 2 сопровождается снижением концентрации молекул адгезии в крови [19]. Это согласуется с результатами экспериментальных работ, показавших стимулирующее влияние супрафизиологических количеств глюкозы на экспрессию молекул адгезии в эндотелиальных клетках [16, 17]. Установлено, что воздействие избытка глюкозы приводит к увеличению адгезии моноцитов [20] и нейтрофилов [16] к сосудистому эндотелию. Аналогичные эффекты оказывают гликированные белки [21]. Таким образом, стимулируя синтез молекул адгезии, гипергликемия запускает развитие иммуновоспалительных реакций в сосудах.

В связи с этим увеличение содержания sICAM-1 в сыворотке крови можно использовать как маркер интенсивности хронического сосудистого воспаления у больных СД. Клиническая значимость данного параметра определяется его тесной взаимосвязью с прогрессированием микроангиопатий. Поскольку содержание sICAM-1 не коррелирует с «традиционными» маркерами воспаления (такими, как количество лейкоцитов, СОЭ и фибриноген), его исследование имеет самостоятельное диагностическое значение.

Как показали наши исследования, уровень sICAM-1 в кровотоке у больных СД 1 в определенной степени отражает активацию синтеза ICAM-1 в клубочках почек. Повышение количества ICAM-1 в почках, однако, обнаруживалось на более ранних стадиях ДН, чем изменения уровня sICAM-1 в кровотоке. Появление ICAM-1 в клубочках и канальцах почек в количествах, выявляемых иммуногистохимическим методом, зафиксировано нами на стадии микроальбуминурии, а в некоторых случаях даже при нормальной экскреции альбумина с мочой.

Полученные данные согласуются с результатами работ, в которых обнаружена повышенная экспрессия ICAM-1 в клубочках [22–25] и тубулоинтерстиции почек [23, 25] на различных экспериментальных моделях СД. Известно, что активация синтеза молекул адгезии является характерным признаком целого ряда заболеваний почек, в патогенезе которых присутствует воспалительный компонент. Повышенная экспрессия ICAM-1 в клубочках обнаружена при различных морфологических формах гломерулонефритов [26, 27], васкулите Шенляйн–Геноха, люпус-нефрите [26]. Активацию экспрессии ICAM-1 в канальцах и/или интерстиции наблюдали при гломерулонефритах [26], тубулоинтерстициальных нефритах [28], реакции отторжения почечного трансплантата [29]. Таким образом, активация синтеза адгезивных белков носит характер универсальной реакции. Вместе с тем факторы, запускающие эту реакцию при разных формах патологии различны.

Проведенные исследования показали взаимосвязь между качеством контроля гликемии и уровнем ICAM-1 в почках. Это соответствует представлениям о том, что гипергликемия является наиболее вероятной пусковой причиной активации синтеза ICAM-1 в почках при СД. In vitro показано, что высокий уровень глюкозы приводит к возрастанию продукции ICAM-1 в эндотелиальных [30] и мезангиальных [31] клетках. Помимо гипергликемии, синтез ICAM-1 в мезангиоцитах может запускать оксидативный стресс [32], а также механическое напряжение в условиях внутриклубочковой гипертензии [33].

Гиперэкспрессия молекул адгезии является необходимым условием привлечения в почки мононуклеарных провоспалительных клеток. Возрастание их числа в клубочках и интерстиции почек при СД зафиксировано в ряде клинических [3, 5] и экспериментальных [6, 22, 23, 25, 34, 35] работ. Инфильтрирующие почки провоспалительные клетки могут включаться в патогенез нефросклероза, вырабатывая фиброгенные факторы роста и цитокины. При СД макрофагальная инфильтрация почечных клубочков и канальцев взаимосвязана с выраженностью фиброза, альбуминурией, артериальной гипертензией и функцией почек [3, 6]. В эксперименте показано, что нейтрализующие ICAM-1 антитела препятствуют развитию макрофагальной инфильтрации клубочков при СД [7]. Мыши линии db/db (модель СД 2) с «нокаутированным» геном ICAM-1, в значительной степени «защищены» от развития нефропатии: у них медленнее нарастает альбуминурия, менее выражены лейкоцитарная инфильтрация и морфологические изменения в клубочках и канальцах, медленнее развивается нефросклероз [8]. Это позволяет рассматривать ICAM-1 в качестве одного из медиаторов, участвующих в развитии ДН.

Дальнейшее изучение роли воспалительных реакций в формировании ДН представляется перспективным для изучения механизмов развития и разработки новых подходов к лечению этого грозного осложнения.

1. Выявлена активация синтеза молекул межклеточной адгезии ICAM-1 в почках и повышение растворимой формы данных молекул (sICAM-1) в сыворотке крови у больных СД 1.

2. Активация синтеза ICAM-1 в канальцах и клубочках почек наблюдается на самых ранних стадиях нефропатии, даже при небольшой длительности СД.

3. Повышение уровня sICAM-1 в крови наиболее характерно для клинически выраженных стадий ДН.

4. Активация синтеза ICAM-1 при СД связана с качеством гликемического контроля, степенью альбуминурии, наличием артериальной гипертензии.

5. Изменения экспрессии ICAM-1 в почках и их уровня в кровотоке подтверждают роль воспалительных реакций в формировании ДН.