Изучить функциональное состояние глюкокортикоидного звена АКС с использованием комплекса методов, включающих измерение кортикостероидов в ткани НП, сыворотке крови и суточной моче, в динамике развития экспериментального диабета в сопоставлении с тяжестью заболевания у крыс.

Работа проведена на половозрелых крысах-самцах породы Вистар (n=55), которых содержали в индивидуальных клетках на стандартном рационе вивария со свободным доступом к воде и пище. При работе с животными соблюдали принципы гуманности, изложенные в Хельсинкской декларации. Для моделирования СД крысам опытной группы однократно внутрибрюшинно вводили раствор аллоксана тетрагидрата («LaChema», Чехия) в дозе 17 мг на 100 г массы тела. Животным контрольной группы в те же сроки однократно вводили аналогичный объем 0,9% водного раствора NaCl. Начиная со вторых и до 24 суток после введения аллоксана, у каждой крысы индивидуально собирали суточную мочу с использованием специально сконструированных мочесборников, измеряли диурез. Крыс выводили из эксперимента через 9, 21 и 30 суток после введения аллоксана. Измеряли массу тела, сердца, почек и НП, рассчитывали относительную массу органа на 100 г массы тела (массовый индекс).

Содержание глюкозы в сыворотке крови и в суточной моче определяли ферментативным методом с использованием наборов «GLU» фирмы BioCon, иммунореактивного инсулина (ИРИ) в сыворотке крови – радиоиммунным методом (рио-ИНС-ПГ-125I «ХОПИБОХ НАНБ», Минск). Концентрацию кортикостероидных гормонов в гомогенатах надпочечниках и плазме крови крыс измеряли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии как описано ранее [4]. Концентрацию прогестерона в гомогенатах надпочечников определяли иммуноферментным методом с использованием наборов Стероид ИФА-прогестерон (ЗАО «Алкор БИО»). Из мочи прогестерон и кортикостерон экстрагировали этилацетатом (отношение объемов мочи и этилацетата 1:10), экстракты выпаривали, остаток растворяли в 0,01 М калий-фосфатном буфере, рН 7,4. Содержание кортикостерона определяли радиоиммунным методом с использованием меченого тритием кортикостерона – [1,2,6,7-3H] Corticosterone (Amersham) и антител к кортикостерону – Corticisterone antiserum (Sigma-Aldrich), прогестерона – методом иммуноферментного анализа (см. выше). Активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ) и содержание белка в гомогенатах печени определяли с использованием наборов фирмы BioCon, активность ферментов выражали в Ед/г белка.

Статистическую обработку результатов проводили методом дисперсионного анализа с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 (Statsoft, США), применяли критерий Краскела-Уоллиса для множественных и непараметрический критерий Манна-Уитни для парных сравнений. Вероятность справедливости нулевой гипотезы принимали при 5% уровне значимости. Данные представлены в виде M±m, где M – выборочное среднее, m – стандартная ошибка.

В первые дни после введения аллоксана у животных отмечено выраженное нарастание диуреза и величины суточной глюкозурии от миллиграммов до нескольких граммов глюкозы в сутки (табл. 1). В дальнейшем, начиная с 7 суток и до конца эксперимента, уровень глюкозурии, а также объем суточной мочи, статистически значимо не менялись.

В динамике развития заболевания параллельно со снижением массы тела отмечено уменьшение массы сердца и увеличение массы почек, в результате массовый индекс сердца не менялся относительно контрольных величин, а почек – повышался более чем в два раза (табл. 2). Содержание глюкозы в сыворотке крови было выше контрольного уровня в несколько раз на всех сроках эксперимента, чему соответствовали результаты, указывающие на сниженную более чем в два раза концентрацию в сыворотке крови ИРИ (см. табл. 2).

Массовый индекс НП также был повышен на всех сроках эксперимента, хотя абсолютная масса НП на 30 сутки заболевания снижалась до величин, соответствующих значению показателя у контрольных животных.

Содержание кортикостерона в сыворотке крови повышалось в два раза относительно величины этого показателя у контрольных крыс через 9 суток, и в три раза – через 21 сутки после начала заболевания. К 30 суткам содержание кортикостерона в сыворотке крови снижалось до величины, статистически значимо не отличающейся от контрольного уровня. Аналогичная динамика была отмечена и для активности индуцируемых глюкокортикоидными гормонами ферментов глюконеогенеза в печени – выраженное повышение активности АСТ и АЛТ на 21 сутки заболевания с последующим снижением величин этих показателей (см. табл. 2).

В таблице 3 представлены результаты определения содержания кортикостероидов в НП крыс в динамике развития аллоксанового диабета. Рассчитывали абсолютное содержание кортикостероидов в нг в одном НП и относительное содержание – в нг/мг ткани НП. Абсолютное содержание прогестерона в НП претерпевало выраженные изменения в динамике диабета – на 9 сутки заболевания снижалось в 5 раз относительно величины этого показателя у контрольных животных, затем начинало повышаться и к концу эксперимента превышало контрольный уровень в два раза. При этом относительное содержание гормона также снижалось на 9 сутки, а через 30 суток после введения аллоксана имело тенденцию к повышению. Такая динамика содержания прогестерона в НП отражает, вероятно, недостаточную активность начальных этапов биосинтеза стероидов в первые дни после введения аллоксана с ее последующим повышением в динамике диабета до величин, необходимых для поддержания синтеза кортикостерона на конечных этапах его биосинтеза.

Изменения содержания в НП 11-дезоксикортикостерона (предшественника в синтезе кортикостерона), кортикостерона и 11-дегидрокортикостерона в динамике диабета носили однонаправленный характер (см. табл. 3). Отмечено повышение величин этих показателей на 9 сутки заболевания, сохранение высокого уровня содержания кортикостероидов в НП на 21 сутки, снижение содержания кортикостероидов, выраженное в наименьшей степени для кортикостерона, к 30 дню диабета. Эти изменения соответствуют динамике концентрации кортикостерона в сыворотке крови (см. табл. 2), что в совокупности позволяет предполагать некоторое снижение к 30 дню заболевания глюкокортикоидной функции НП, которая, тем не менее, остается повышенной относительно контрольного уровня. Подтверждением этого предположения могут служить данные по уменьшению в НП содержания 11-дегидрокортикостерона – обратимого метаболита кортикостерона, который при недостатке синтеза глюкокортикоидных гормонов может вновь превращаться в физиологически активный гормон ферментом 11β-оксистероиддегидрогеназой, способствуя тем самым повышению концентрации кортикостерона [9].

На рисунке 1 представлены результаты измерения экскреции неметаболизированных кортикостероидов – прогестерона и кортикостерона, с мочой в динамике диабета. Изменения суточной экскреции прогестерона с мочой у крыс в динамике диабета носили фазный характер, что было особенно выражено в первые дни заболевания. На 8–9 сутки экскреция прогестерона была сопоставима с величиной этого показателя у контрольных животных. Затем отмечено стойкое повышение экскреции прогестерона, которое сохранялось до конца эксперимента. Содержание кортикостерона в суточной моче монотонно нарастало до 8–9 суток диабета, затем экскреция этого кортикостероида поддерживалась на уровне, в 6–7 раз превышающем величину соответствующего показателя у контрольных животных. Результаты определения экскреции неметаболизированных кортикостероидов с мочой также указывают на стойкую активацию их синтеза в НП в динамике аллоксанового диабета.

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о том, что в динамике развития диабета после введения аллоксана первая неделя заболевания характеризуется нарастанием тяжести метаболических нарушений, выраженность которых затем, так же как и гипоинсулинемии, вплоть до 30 суток существенно не меняется. При этом уже к 9 дню диабета развивается поражение таких органов, как сердце и почки. Физиологические эффекты глюкокортикоидных гормонов, способствующие увеличению тяжести заболевания, продолжают нарастать до 21 суток заболевания, что подтверждается повышением активности аминотрансфераз в печени. К 30 суткам диабета, несмотря на сохраняющиеся стойкие нарушения углеводного метаболизма, отмечены признаки снижения выраженности физиологических эффектов глюкокортикоидных гормонов, что может быть связано с уменьшением синтеза кортикостерона в НП и снижением его содержания в крови.

В публикациях последних лет, как правило, указывают на использование в работе экспериментальных моделей аллоксанового диабета с достаточно короткими сроками заболевания (2–3 недели) [10, 11], в то время как в ранних исследованиях изучали особенности и хронического течения заболевания [12]. Было показано, что продолжительность аллоксанового диабета у крыс может быть довольно значительной – до 1 года, с частой возможностью спонтанного восстановления нормогликемии. Этому процессу может способствовать не только восстановление структуры и функции островкового аппарата поджелудочной железы [12], но и снижение функциональной активности глюкокортикоидного звена АКС, признаки которого в нашем исследовании были отмечены уже через месяц после начала заболевания.