Сахарный диабет 1 типа (СД1) - заболевание, связанное с нарушением (дефектом) иммунологической толерантности к собственнымантигенам и селективным разрушением ?-клеток панкреатических островков СD8+ (цитотоксическими) и СD4+ (эффекторными) лим-фоцитами. Механизмы поддержания аутотолерантности включают CD4+CD25+high T-регуляторные клетки (Treg), супрессивная активность которых определяется экспрессией в них гена FoxP3.Цель. Определение количественных и функциональных изменений, происходящих на уровне регуляторного звена иммунитета у лиц в группериска развития СД1 и у пациентов с различной длительностью СД1.Материал и методы. В исследование было включено 116 больных (67 мужчин, 49 женщин) СД1 с различной длительностью заболевания,33 человека (10 мужчин, 23 женщины) составили группу риска и 16 человек - контрольную группу. У всех обследуемых было проведеноHLA-генотипирование, определение аутоантител к глютаматдекарбоксилазе (ГДК), инсулину, тирозинфосфатазе, антигенам ост-ровковых клеток, определение субпопуляционного состава лимфоцитов CD3+, CD4+, CD8+, CD38+, HLA DR+, CD25+, CD4+25+ и их функ-циональной активности (интенсивности экспрессии гена FoxP3), С-пептида, HbA1c . Результаты. Отмечена тенденция к повышению относительного количества CD25+ и CD4+25+ T-лимфоцитов и тенденция к сниже-нию экспрессии гена FoxP3 в группе риска по сравнению с контролем (р<0,1). В этих группах определялась достоверная разница в про-центном содержании активационных молекул CD38 и HLA-DR+ (p<0,05). В группе больных с впервые выявленным СД количествоТ-регуляторных лимфоцитов не отличалось от такового в группе контроля (p>0,05). Однако их функциональная активность (уровеньэкспрессии гена FoxP3) была достоверно ниже, чем в контроле (p<0,001). Низкая интенсивность экспрессии гена FoxP3 в сравнениис контролем в дальнейшем отмечалась при любой продолжительности заболевания. Заключение. Впервые определена интенсивность экспрессии гена FoxP3 и количество CD4+CD25+hight T-регуляторных клеток при раз-личной длительности СД. Выявлено достоверное снижение функциональной активности Т-регуляторных клеток при любой длительно-сти заболевания, несмотря на отсутствие существенной разницы в их количестве у больных СД1 по сравнению с контрольнымизначениями. У пациентов группы риска отмечено достоверное увеличение пула активированных лимфоидных клеток, повышение содер-жания Тreg и снижение экспрессии гена FoxP3.
Type 1 diabetes mellitus (DM1) is associated with compromised (defective) immunologic tolerance to autoantigens and selective destruction of pancreatic B-cells by CD4+ (effector) and CD8 (cytotoxic) lymphocytes. The mechanisms of autotolerance involve CD4+CD25+high T-regulatory cells (Treg) whose suppressor activity depends on the expression of the FoxP3 gene. Aim. Detection of quantitative and functional alterations at the level of regulation of immunity in subjects at risk of DM1 and patients with different duration of DM1. Materials and methods. 116 patients (67 men and 49 women) with different duration of DM1. The risk group was comprised of 33 subjects (10 men and 23 women), control group included 16 subjects. In all cases, HLA genotyping was performed, autoantibodies to GDC, insulin and tyrosine phosphatase, islet cell antigens were determined, subpopulation composition of CD3+, CD4+, CD8+, CD38+, HLA DR+, CD25+, CD4+25+ lymphocytes and their functional activities (FoxP3 gene expression) studied, C-peptie and HbA1c levels measured. Results. A tendency toward a rise in Cd25+ and CD4+25+ T-lymphocytes and a decrease in FoxP3 expression was documented in the risk group compared with control (p0.05) but their functional activity was lower (p
Сахарный диабет 1 типа (СД1) – заболевание, связанное с дефектом иммунологической толерантности к собственным антигенам и селективным разрушением β-клеток панкреатических островков СD8+ (цитотоксическими) и СD4+ (эффекторными) лимфоцитами.
В настоящее время основной группой лимфоидных клеток, отвечающих за поддержание аутотолерантности, считают пул СD4+ лимфоцитов, экспрессирующих СD25 маркёрную молекулу – α-цепь рецептора IL-2 (IL-2R) [
Функциональные свойства Тreg опосредованы активностью FoxP3 (forkhead box) [
Участие Тreg в регуляции аутоиммунных процессов при СД1 подтверждается фактом ассоциации СД1 с IPEX-синдромом (Immune dysregulation, Polyendocrinopathy, Enteropathy, and X-linked inheritance) – моногенным аутоиммунным синдромом, сцепленным с Х-хромосомой, проявляющимся иммунной дисрегуляцией, полиэндокринопатией и энтеропатией [3, 4, 5]. IPEX-синдром развивается в результате мутации гена FoxP3 [3, 6]. Супрессивная активность Тreg непосредственно зависит от интенсивности экспрессии гена FoxP3 [7, 8, 9, 10]. Снижение количества или супрессивной активности этих клеток могут способствовать потере аутотолерантности к антигенам β-клеток и развитию аутоиммунного процесса [9, 12].
В литературе приводятся достаточно противоречивые данные по характеру изменений количественных и функциональных показателей этих клеток при различных заболеваниях, в том числе на фоне СД1.
Целью настоящей работы стало определение количественных и функциональных изменений, происходящих на уровне регуляторного звена иммунитета у лиц в группе риска развития СД1 и у пациентов с различной длительностью СД1.
В исследование было включено 116 больных (67 мужчин, 49 женщин) СД1 с различной длительностью заболевания, 33 человека (10 мужчин, 23 женщины) составили группу риска и 16 человек – контрольную группу.
Больные СД1 были разделены в зависимости от длительности заболевания на следующие группы: впервые выявленный СД1 (1-й год заболевания/после постановки диагноза) – 59 человек, с продолжительностью СД от 1 года до 5 лет – 16, от 5 до 10 лет – 15, свыше 10 лет – 26. Медиана возраста дебюта заболевания СД1 составила 27,0 лет [21,0; 33,0], индекс массы тела (ИМТ)=21,88 кг/м2 [20,59; 23,93]. HbA1c в первой группе составил 9,1 % [6,4; 14,1], С-пептид – 0,7 нг/мл [0,5 ; 0,8], во второй: HbA1c – 7,2 % [6,4; 9,8], С-пептид – 1,2 нг/мл [0,6; 1,8]; в третьей: HbA1c – 8,6 % [7,4; 9,8], С-пептид – 0,5 нг/мл [0,3; 0,8], в четвертой: HbA1c – 9,2 % [6,8; 11,9], С-пептид – 0,3 нг/мл [0,1; 0,8].
В группу риска вошли обследованные пациенты с положительными результатами повторного определения аутоантител, ассоциированных с развитием СД1 (GADA, IA-2A, ICA, IAA). Пациенты были в возрасте 28,5 лет [21,5; 35,5], с ИМТ=26,03 кг/м2 [22,77; 30,15], HbA1c – 5,6% [5,4; 5,7], базальным уровнем C-пептида в крови – 1,7 нг/мл [1,2; 14,0]. У 3 человек из группы риска родственники первой степени родства болели СД1.
Контрольную группу составили 16 практически здоровых лиц (9 мужчин и 7 женщин), сопоставимых по возрасту с пациентами исследуемых групп. Критериями включения в контрольную группу были: отсутствие нарушений углеводного обмена и отрицательные аутоантитела к антигенам β-клетки (GADA, IA-2A, ICA, IAA). Для определения диапазона нормальных показателей интенсивности экспрессии гена Fox P3 было обследовано 85 здоровых доноров.
Критериями исключения из исследования была вакцинация и прием иммуномодулирующих препаратов в течение предшествующего года.
Диагноз впервые выявленного СД1 ставился на основании клинической картины и данных лабораторного обследования в соответствии с критериями ВОЗ [
Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови проводили с помощью наборов пробоподготовки «DNA prep». ДНК-типирование выполнялось по аллельным вариантам трех генов HLA II класса: DRB1 (14 специфичностей), DQA1 (8 аллелей) и DQB1 (13 аллелей) методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для определения полиморфных аллелей данных генов применялись коммерческие наборы производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология». ПЦР проводилась согласно регламенту, указанному производителем. Амплификацию проводили на амплификаторе «Терцик». Идентификацию продуктов амплификации проводили после электрофореза в 3% агарозном геле и окрашивания продуктов амплификации бромистым этидием. Гаплотипы составлялись на основе известных таблиц сцепления.
Иммунологическое исследование включало определение аутоантител к цитоплазматическим структурам β-клеток (ICA), к глутаматдекарбоксилазе (GADA), к тирозинфосфатазе (IA-2A) и антиинсулиновых аутоантител (IAA). Количественное определение ICA, GADA и IAA в сыворотке крови обследованных определяли с помощью иммуноферментных наборов «Isletest-ICA, GADA, IAA» фирмы «Biomerica» согласно методике производителя. Количественное определение IA-2A в сыворотке крови осуществляли методом иммуноферментного анализа с использованием наборов «Medizym» фирмы «Medipan MGBH».
Содержание гликированного гемоглобина (HbA1c) определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) на аппарате D-10 («Bio-Rad») по стандартной методике производителя.
Определение базальной концентрации С-пептида в крови для оценки функционального состояния β-клеток проводили иммунохемолюминисцентным методом на аппарате «Elecsys 2010» («Roche»).
Определение субпопуляционного состава лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, CD25+, CD38+, CD95+, CD95L+, DR+) периферической крови проводили на проточном цитометре «FACSCalibur» с использованием моноклональных антител одинарной и двойной меткой («Becton Dickinson») к дифференцировочным антигенам лимфоцитов по стандартной методике. При этом оценивали процентное содержание, экспрессию дифференцировочных антигенов и абсолютное количество указанных субпопуляций лимфоидных клеток.
Для определения интенсивности экспрессии гена FoxP3 проводилось выделение тотальной РНК из образцов крови данных групп пациентов и получение кДНК по матрице РНК. Определение интенсивности экспрессии гена FoxP3 было проведено методом ПЦР в режиме реального времени (Real-time PCR). Для проведения Real-time PCR были синтезированы праймеры и отработаны оптимальные условия амплификации. При оптимизации метода Real-time PCR был определен диапазон значений, в котором соблюдается линейная зависимость интенсивности флюоресценции от концентрации кДНК.
Статистическая обработка результатов исследования выполнена с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 для Windows. Сравнение показателей выделенных групп пациентов проводилось по U-критерию Манна-Уитни. Корреляционный анализ осуществлялся непараметрическим методом ранговой корреляции по Спирмену. Количественные показатели представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха [Q25; Q75]. Критический уровень значимости принимался равным 5%.
В группе риска преобладали пациенты с положительными титрами GADA и с комбинациями GADA с ICA и IAA (табл. 1).
При HLA-типировании в группе риска были получены результаты преобладания частоты встречаемости протективных гаплотипов и генотипов по сравнению с классическими предрасполагающими. В качестве «предрасполагающих» и «протективных» мы рассматривали следующие гаплотипы:
«Предрасполагающие» гаплотипы:
«Протективные» гаплотипы:
Показатели субпопуляционного состава лимфоцитов в группе риска и в контрольной группе представлены в таблице 3.
У пациентов группы риска мы выявили достоверное повышение относительного и абсолютного количества CD38+- и DR+-лимфоцитов (p<0,05). Наблюдаемая тенденция повышения относительного количества CD25+ и CD4+CD25+hight-клеток, а также снижение абсолютного количества CD95L+-лимфоцитов по сравнению с контролем оказались статистически недостоверны (p>0,05).
При проведении корреляционного анализа мы обнаружили сильную отрицательную связь между относительным количеством лимфоцитов, экспрессирующих CD95L на поверхности, и базальной концентрацией С-пептида (r=-0,94; p=0,05), что может быть связано с начальными явлениями апоптоза β-клеток.
Результаты определения интенсивности экспрессии гена FoxP3, полученные в группе риска, могут свидетельствовать о постепенно снижающейся способности Тreg подавлять Т-клеточную пролиферацию, а увеличение содержания этих клеток можно считать компенсаторным явлением.
Все это отражает наличие общей напряженности иммунной системы на этой стадии процесса.
В группе больных СД1 при HLA-типировании выявлено преобладание классических предрасполагающих гаплотипов и генотипов по сравнению с протективными (табл. 4).
Наличие и распределение аутоантител представлено в таблице 5. Обращает на себя внимание отсутствие аутоантител у значительного числа пациентов с длительностью СД1 до 1 года, что может быть связано с развитием ремиссии у данного контингента больных.
Субпопуляционный состав лимфоидных клеток в группе больных СД1 с различной продолжительностью заболевания представлен в таблице 6.
У пациентов с СД1, как и в группе риска, мы отмечали достоверное повышение относительного и абсолютного количества CD 38+- и DR+-лимфоцитов (p<0,05). В группе больных с впервые выявленным СД1 количество Тreg не отличалось от такового в группе контроля (p>0,05).
Однако функциональная активность Тreg (интенсивность экспрессии гена FoxP3) была достоверно ниже, чем в контроле (0,39 [0,18–0,71] vs. 1,11 [0,66–2,26], Z=5,26, p<0,001). Низкая интенсивность экспрессии гена FoxP3 в сравнении с контролем в дальнейшем отмечалась при любой продолжительности заболевания: при длительности диабета от 1 до 5 лет (0,37 [0,18–0,89], Z=2,62, p=0,009); от 6 до 10 лет (0,14 [0,11–0,31], Z=3,33, p=0,0009); свыше 10 лет (0,47 [0,17–0,86], Z=3,15, p=0,0016).
У пациентов с СД1 мы выявили сильную отрицательную корреляционную связь между интенсивностью экспрессии гена FoxP3 и титром GADA (r=-0,95, p=0,05), что может свидетельствовать об ослаблении лимфопролиферативной способности клеток. Также в данной выборке пациентов была выявлена взаимосвязь интенсивности экспрессии гена FoxP3 и маркёрной молекулы CD95L (r=0,52, p=0,05). Последнее может свидетельствовать о том, что проапоптотическая активность у людей с СД1 выражена в большей степени, чем у пациентов в группе риска.
Таким образом, можно предположить, что у пациентов из группы риска для компенсации функционального дефицита Тreg возникает увеличение численности Тreg, которое, однако, нельзя рассматривать как показатель роста активности этих клеток. Сохраняющий функциональный дефицит Тreg сопровождается дальнейшим снижением экспрессии гена FoxP3 и обусловливает развитие СД1.
Полученные результаты согласуются с результатами ряда авторов [
Во многих исследованиях авторы обращают внимание не только на сниженное абсолютное или относительное количество Тreg при СД1, но и на нарушение их супрессорной (регуляторной) функции. Так, в исследовании Jin Y. и соавт. [
В исследовании на животных моделях СД1 также подтверждена важная роль Тreg в патогенезе СД1. Более того, у животных разработано множество достоверно эффективных методов предотвращения развития СД1 и его излечения, включающих специфические воздействия на субпопуляцию Тreg и приводящих, в первую очередь, к увеличению их абсолютного количества и изменению соотношения популяций Th1- и Th2-лимфоцитов. Так, в исследовании Jan-Luuk Hillebrands и соавт. [
У пациентов группы риска отмечено достоверное увеличение пула активированных лимфоидных клеток, повышение содержания Тreg и снижение экспрессии гена FoxP3.
При любой длительности СД1 наблюдается снижение интенсивности экспрессии гена FoxP3 (несмотря на отсутствие существенной разницы в содержании Тreg в крови), что может приводить к пролиферации аутореактивных цитотоксических Т-лимфоцитов.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.