Materials and methods. HLA genotyping was accomplished in 51 DM1 patients and 51 volunteers randomly selected from the indigenous populationof Yakutia (Yakuts in three successive generations). Another 205 DM1 patients and 300 healthy subjects comprised random samples of patients andcontrols respectively from residents of Moscow and Moscow region. Results. HLA DRB1*17(03) allele proved to be the strongest one predisposing to DM1 in the Yakutian population (relative risk, RR=8,47) andDQB1*0304 in the Moscow population (RR=8,94). The presence of DRB1*04, DRB1*17(03), DQA1*0301, DQB1*0201, and DQB1*0302 accountedfor RR >2 in both populations. Only two alleles, DRB1*04 and DRB17(03), in the Yakutian population and five of the six (DRB1*04,DRB1*17(03), DQA1*(0301), DQB1*0302, and DQB1*0304) in the Moscow one were closely associated with DM1 (RR >4). DRB1*09, DRB1*11,DQB1*13, DQB1*0602/8 in Yakutian and DRB1*11, DRB1*13, DQA1*0103, DQB1*0301, DQB1*0602/8 in Moscow populations had the highestprotective potential (RR<2). The Yakuts appear to show a broader spectrum of protective alleles. However, the study gave no definitive evidence ofthe protective role of widespread DQB1*0602/8 and DRB1*15 alleles inherent in both Russian and Finnish populations. Conclusion. These molecular genetic data can be of use for medicogenetic consultation to estimate the risk of DM1 in the Yakutian population.
Cахарный диабет 1 типа (СД1) является многофакторным, полигенным заболеванием. Многочисленные исследования продемонстрировали, что при всем многообразии выявленных локусов предрасположенности, наибольший вклад в развитие заболевания вносят гены локуса HLA класса II, уровень полиморфизма которых значительно различается в популяциях [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7].
Уровень заболеваемости СД1 в разных странах мира очень вариабелен. Наиболее высокий – в Финляндии (40 случаев на 100 тыс. детского населения) [8, 9], самый низкий уровень отмечается в азиатских странах и составляет 2,37 на 100 тыс. (Япония) (рис.1) [
Изучение ассоциации генов HLA класса II с СД1 в разных популяциях позволяет не только проводить индивидуальную оценку риска развития заболевания, но и проводить разработку больших скрининговых программ, направленных на профилактику СД1. Ярким примером таких программ являются финские исследования [8, 9].
Финское исследование Diabetes Prediction and Prevention (DIPP) посвящено разработке методов профилактики в общей популяции. Все младенцы, родившиеся в трех университетских больницах Финляндии, были подвергнуты скринингу на маркеры HLA-DQB1 с использованием образцов пуповинной крови. Лица с высоким генетическом риском были взяты под наблюдение. В этой категории проводился скрининг на иммунологические маркеры с интервалом от 3 до 12 месяцев до достижения возраста 10 лет. В дальнейшем дети, входящие в группу высокого риска по развитию СД1, т.е. имеющие высокий генетический и иммунологический риск, были приглашены участвовать в интервенционном исследовании с интраназальным введением инсулина [8, 9].
Финское исследование Trial in Genetically at Risk (TRIGR) направлено на снижение частоты возникновения диабета у детей, имеющих высокий генетический риск. Профилактика проводится путем исключения в течение первых шести месяцев жизни белков коровьего молока из питания младенцев с высоким риском в семьях с одним больным СД1. Младенцам проводят скрининг на генетическую предрасположенность к заболеванию с использованием образцов пупочной крови. В исследование включаются лица, положительные по HLA-DQB1 *0302 и/или *02 и отрицательные по защитным аллелям (*0602-03), *0301. Такие новорожденные имеют очень высокий риск манифестации диабета в возрасте до 10 лет. В соответствии с данными финского исследования DiMe, 29% таких сибсов к возрасту 6 лет дают положительную реакцию на несколько аутоантител, связанных с заболеванием, и 17% развивают клиническую картину СД1 к возрасту 10 лет [8, 9, 12].
Настоящая работа посвящена изучению ассоциации полиморфных генов HLA класса II с СД1 в якутской популяции и сравнению с данными по русской популяции.
Якутия – один из самых больших субъектов Российской федерации: ее площадь составляет около 3 млн кв. км, т.е. она занимает пятую часть Российской Федерации. Общая численность населения составляет 217 105 человек и включает якутов, русских, тунгусов, юкагиров и эвенков.
Известно, что у представителей монголоидной расы заболеваемость СД1 значительно ниже, чем у европейцев [10, 13].
В Якутии общая заболеваемость СД составляет 6,8 на 100 тыс. детского населения. При этом заболеваемость у якутов – 1,6, у русских – 11,9 на 100 тыс. детского населения [
Популяционно-генетические исследования системы HLA, проведенные В.В. Фефеловой среди монголоидных популяций Сибири, показали, что якуты по происхождению ближе к европеоидам, чем к монголоидам. По предположению исследователя, произошло смешение древних европеоидов с монголоидными племенами, что могло превратить предков якутов в тюркоязычную монголоидную этническую общность [
В серии работ проведено изучение распределения аллелей генов HLA-DQA1/B1 в русской популяции [3, 4, 5]. Так, у больных СД1 достоверно чаще встречаются аллели DQA1*0301 и *0401, DQB1*0201 и *0302 и достоверно реже по сравнению с контрольной группой аллели DQA1*0101 и *0201, DQB1*0503, *0602, *0803 и *0301 [7, 15, 16]. В японской популяции характерны другие предрасполагающие и предохраняющие аллели и гаплотипы: DRB1*0405-DQB1*0401, DRB1*0901-DQB1*0303 и DRB1*1502-DQB1*0601, DRB1*1501-DQB1*0602 соответственно [
Образцы крови собраны у 51 больного СД1 и 51 добровольца из случайной выборки коренного населения Якутской области (якуты в трех поколениях), а также у 204 больных СД1 и 300 здоровых лиц из случайной выборки г. Москвы и Московской области.
Выделение ДНК из цельной крови человека проводили с помощью обработки протеинкиназой К и экстракции фенолом и хлороформом или с использованием хелатного полимера Chelex R-100.
Идентификацию аллелей генов HLA проводили методом мультипраймерной аллель-специфической полимеразной цепной реакции, используя наборы ЗАО «НПФ ДНК-Технология» (Россия). Обозначение специфичностей генов HLA соответствует общепринятой номенклатуре.
Фрагменты ДНК после амплификации разделяли в агарозных гелях. Электрофоретическое разделение в 3%-х агарозных гелях проводили в горизонтальной камере. По окончании электрофореза гели окрашивали бромистым этидием (0,5 мкг/мл) и просматривали в ультрафиолетовом свете.
Статистический анализ результатов проводился с использованием таблиц сопряженности и критерия Фишера. Достоверным считали различия при р<0,05.
Сравнение «силы» генетического маркера проводили по показателю относительного риска. Показатель абсолютного риска характеризует вероятность развития заболевания у носителей данного маркера и рассчитывается по специальным формулам. Относительный риск (обозначается обычно ОР) показывает, во сколько раз риск развития заболевания выше/ниже у лиц, имеющих этот маркер, по сравнению с лицами, не имеющими данного генетического маркера. Показатель ОР используется обычно для сравнительной характеристики изучаемых маркеров.
Показатель ОР рассчитывается по формуле:
OР = (a + 0,5)(d + 0,5) / (b + 0,5)(c + 0,5),
где а – число лиц с наличием и b – с отсутствием данного аллеля среди больных пациентов, с и d – число лиц с наличием и отсутствием данного аллеля среди здоровых лиц, соответственно, поправка 0,5 в этой формуле используется в случае малых выборок. ОР>1 рассматривали как положительную ассоциацию, ОР<1 – как отрицательную ассоциацию аллеля с заболеванием.
В настоящей работе проводили определение частот предрасполагающих и предохраняющих полиморфных аллелей HLA-DQ и DRB1-генов в Якутской популяции. Учитывая значительную разницу в заболеваемости московской и якутской популяций, проводили также сравнительный анализ состава и распределения аллелей в группах здоровых лиц и больных СД1 в двух популяциях (табл. 1, 2).
На рис. 2 представлено распределение частот полиморфных аллелей HLA-DQ и DRB1-генов у больных СД1 и в группе контроля якутской популяции. У больных СД1 по сравнению с контрольной группой достоверно чаще встречались следующие аллели: DRB1*17 (03), DRB1*04, DQA1*0301, DQB1*0201, DQB1*0302, DQB1*0201 (p<0,05). Аллели DRB1*13, DRB1*11, DRB1*09 DQA1*0101, DQA1*0103, DQB1*0301, DQB1*0303 и DQB1*0602/8 чаще встречаются в контрольной группе по сравнению с группой больных (p<0,05).
Показатель ОР для предрасполагающих аллелей составил (рис. 3): DRB1*17 (03) (ОР=8,47; p<0,0001), DRB1*04 (ОР=4,27; p<0,0001), DQA1*0301 (ОР=2,38; р=0,004), DQB1*0201 (ОР=3,28; p<0,001), DQB1*0302 (ОР=3,95; p<0,001). Для протекторных аллелей получены следующие показатели ОР: DRB1*13, DRB1*11 и DRB1*09 (ОР=0,16; p<0,0001, ОР=0,1; p=0,023 и ОР=0,15; p=0,013 соответственно), DQA1*0101, DQA1*0103 (ОР=0,23, p=0,032; ОР=0,26, p<0,026 соответственно), DQB1*0301 (ОР=0,21; p<0,003), DQB1*0303 (ОР=0,21; p<0,019) и DQB1*0602/8 (ОР=0,17; p<0,001) (рис. 4).
Однако в якутской популяции самым «сильным предрасполагающим аллелем оказался DRB1*17(03) (ОР=8,47), в московской популяции наиболее высокое значение ОР определено для аллеля DQB1*0304 (ОР=8,94). Аллель DQB1*0304 в якутской популяции ни среди больных, ни среди здоровых лиц в исследованных выборках не встречается (табл. 1). В московской популяции с СД1 высокую ассоциацию проявляют такие же аллели, как и в якутской: аллели DRB1*04, DRB1*17(03), DQA1*0301, DQB1*0201, DQB1*0302 имеют относительный риск (ОР>2) как в якутской, так и в московской популяциях (табл. 2).
Высоко ассоциированы с сахарным диабетом (ОР>4) в якутской популяции только два аллеля – DRB1*04, DRB1*17(03), а в московской популяции – пять из шести DRB1*04, DRB1*17(03), DQA1*0301, DQB1*0302, DQB1*0304 (рис. 3).
Среди предохраняющих аллелей (рис. 4) наибольшей защитной силой (ОР<0,2) обладают в якутской популяции четыре аллеля (DRB1*09, DRB1*11, DRB1*13, DQB1*0602/8), а в московской – пять аллелей (DRB1*11, DRB1*13, DQA1*0103, DQB1*0301, DQB1*0602/8). Из них наиболее высокий риск проявляют в московской популяции DRB1*13 и DQB1*0602/8, в якутской – DRB1*11.
При сравнительном анализе распределения частот аллелей полиморфных HLA-DQ и DRB1-генов в контрольных группах (рис. 5) отмечено достоверное увеличение частоты следующих предохраняющих аллелей в якутской популяции: DRB1*09, DQB1*0303, и один предохраняющий аллель DQА1*0102 чаще встречается в русской популяции. Аллели DRB1*09, DQB1*0303 являются предохраняющими только в якутской популяции. Таким образом, два из трех предохраняющих аллелей, достоверно различающихся по частоте в этих популяциях, выявлены в якутской популяции. Из всех предрасполагающих аллелей только DQA1*0301 достоверно чаще встречается в якутской популяции, но ОР развития СД1 у его носителей составляет всего 2,37 в якутской популяции, в то время как в Московской – 5,7.
Далее был проведен сравнительный анализ распределения частот аллелей полиморфных HLA-DQ и DRB1-генов у больных СД1 в якутской и московской популяциях (рис. 6). Только для двух аллелей выявлена достоверная разница в частоте DQA1*0301 и DQA1*0201. Частота DQA1*0301 была достоверно выше в якутской популяции по сравнению с московской в группе контроля, но среди больных СД1 достоверно ниже у якут. Следует учесть, что DQA1*0301 является предрасполагающим аллелем с высоким ОР в московской популяции (ОР>4) и средним в якутской.
Сравнивая распределение аллелей у якутов и русских, можно отметить, что общая частота всех предохраняющих аллелей в якутской популяции по сравнению с московской выше, а предрасполагающих – ниже. Предрасполагающий аллель к развитию СД1 с максимальным показателем OР (DQB1*0304, ОР – 8,94) в русской популяции не встречается в якутской популяции.
Для якутской популяции характерен более широкий спектр предохраняющих аллелей. При этом широко распространенные аллели: DQB1*0602-8, DRB1*15, типичные для русской и финской популяций, достоверно не подтверждены как предохраняющие в Якутии. ОР предрасполагающих аллелей в среднем ниже в якутской популяции, что свидетельствует о большой его силе, учитывая отрицательное значение ОР для предохраняющих аллелей. Различия в частотах аллелей контрольной группы в московской и якутской популяциях более выражены, чем среди больных СД1 в этих популяциях. Эти данные подтверждают роль генетического фактора в формировании более низкого уровня заболеваемости сахарным диабетом в якутской популяции. Определенное значение вероятно, имеет отсутствие сильного предрасполагающего аллеля и высокая частота и разнообразие предохраняющих аллелей в якутской популяции.
Наряду с этим в формировании более низкого уровня заболеваемости СД1 среди якутов могут играть роль и другие факторы внешней среды. Якутская популяция является менее урбанизированной, чем русская. Главным занятием якутов было разведение лошадей и крупного рогатого скота, продукты животноводства традиционно занимали главенствующее значение в питании. На первом месте стояла молочная пища, затем мясная, далее – рыбная и на последнем месте – растительная [
Различия в распределении предрасполагающих и предохраняющих аллелей генов HLA класса II, природные и этнические особенности быта могут объяснить меньшую заболеваемость СД1 среди якутского населения.
Полученные молекулярно-генетические данные могут быть использованы медико-генетическом консультировании для оценки риска развития СД1 в якутской популяции.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.