Согласно оценкам Международной федерации диабета, не менее 8,75 млн человек в мире живут с сахарным диабетом 1 типа (СД1), из них 5,56 млн составляют люди молодого и трудоспособного возраста [1]. По данным Федерального регистра СД1, в России зарегистрировано более 290 тысяч пациентов с СД1. Средняя фактическая продолжительность жизни при СД1 в России составляет около 53 лет, основными причинами преждевременной смерти являются сердечно-сосудистые осложнения [2].

В исследовании по контролю и осложнениям диабета (DCCT: the Diabetes Control and Complications Trial) и в его последующей наблюдательной фазе (EDIC: the Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications study) доказана роль гипергликемии в развитии сосудистых осложнений СД1 [3]. В последние годы установлено, что не только гипергликемия, но и повышенная вариабельность уровня глюкозы (ВГ) способствует развитию диабетических осложнений [4][5]. В частности, показана роль долгосрочной ВГ, оцениваемой по изменчивости уровня гликированного гемоглобина (HbA1c), в развитии сердечно-сосудистых осложнений [6]. Повышенная ВГ активирует воспалительные реакции, процессы свободно-радикального окисления, запускает дисфункцию эндотелия и клеток крови, нарушения ангиогенеза, процессы фиброгенеза в почках [7][8].

Более 15 лет назад A. El-Osta и соавт. было показано, что транзиторное нефизиологическое повышение уровня глюкозы индуцирует эпигенетические модификации в промоторе гена ядерного фактора NK-kB, связанного с воспалительным ответом. Это ведет к сохранению гиперактивности фактора и после нормализации уровня глюкозы [9]. В исследованиях A. Ceriello и соавт. установлено, что интермиттирующая гипергликемия вызывает более выраженный провоспалительный ответ в эндотелиальных клетках человека, чем стабильно повышенный уровень глюкозы; исследования с использованием клэмп-технологий показали роль гипогликемии как триггера воспалительных реакций [10][11]. Эти данные позволяют предполагать, что высокая ВГ с эпизодами гипергликемии и гипогликемии способствует развитию воспаления при СД. В свою очередь, хроническое субклиническое воспаление, или воспаление низкой интенсивности, рассматривается как важный компонент сердечно-сосудистого континуума [12]. У больных СД1 маркеры воспаления ассоциированы с микрососудистыми и макрососудистыми осложнениями [13].

Появление метода непрерывного мониторинга уровня глюкозы (НМГ) значительно расширило возможности оценки ВГ у больных СД. Это, в свою очередь, способствовало формированию представлений о краткосрочной (суточной) ВГ как факторе, значимом с клинической и патогенетической точки зрения [14]. У больных СД1 показаны ассоциации параметров ВГ, рассчитанных по данным НМГ, с уровнем высокочувствительного C-реактивного белка (вчСРБ) [15], некоторых провоспалительных цитокинов [16][17], биомаркерами тромбоза [18], параметрами липидного профиля [19]. Однако многие клинически и патофизиологически важные аспекты эффекта ВГ пока еще недостаточно ясны. В частности требует уточнения значимость различных характеристик ВГ в развитии воспаления и других механизмов патогенеза. Это послужило основанием для проведения нашего исследования.

Определить ассоциации маркеров воспаления низкой интенсивности и цитокинов в сыворотке крови со временем в диапазонах и параметрами ВГ, установленными по данным НМГ, у больных СД1.

Место и время проведения исследования

Набор участников исследования проводили в клинике НИИКЭЛ — филиал ИЦиГ СО РАН с июня 2020 по май 2023 г.

Изучаемая популяция

Участниками исследования были пациенты с СД1 (18–65 лет; основная группа) и лица с нормальной толерантностью к глюкозе (контроль). В исследование не включали лиц с сопутствующими иммуновоспалительными заболеваниями, инфекциями, перенесенными в течение последних трех месяцев, терминальной стадией хронической болезни почек (ХБП). Полный список критериев включения и невключения в исследование приведен в нашей предыдущей работе [20].

Способ формирования выборки из изучаемой популяции

В исследование включались пациенты с СД1, получавшие плановую высокотехнологичную или специализированную медицинскую помощь. Контрольную группу формировали из числа сотрудников Института и их родственников.

Дизайн исследования

Проведено одноцентровое наблюдательное одномоментное сравнительное исследование.

Скринировано 555 больных СД1 и 35 лиц без СД, соответствовавших критериям включения. После оценки критериев исключения в исследование включено 470 пациентов с СД1 и 27 лиц с нормальной толерантностью к глюкозе.

На первом этапе больным СД1 проводили клиническое обследование, НМГ в режиме реального времени с анализом времени в диапазонах и индексов ВГ, а также определение маркеров воспаления. При анализе учитывали время в целевом диапазоне (Time In Range, TIR: 3,9–10 ммоль/л), время в диапазоне выше целевого (Time Above Range, TAR:>10 ммоль/л), время в диапазоне ниже целевого (Time Below Range, TBR:<3,9 ммоль/л) [21]. Для анализа ВГ рассчитывали коэффициент вариабельности (Coefficient of Variation, CV), среднюю амплитуду колебаний гликемии (Mean Amplitude of Glycemic Excursions, MAGE) и скорость изменений уровня глюкозы (Mean Absolute Glucose rate of change, MAG) [14]. Для оценки выраженности воспаления низкой интенсивности определяли концентрацию вчСРБ в сыворотке крови, фибриногена в плазме крови, рассчитывали нейтрофильно-лимфоцитарное соотношение (НЛС) и индекс системного иммунного воспаления (ИСИВ) [22].

На втором этапе исследования из 470 пациентов, включенных в первый этап, случайным образом была сформирована выборка из 130 больных для проведения исследования концентраций цитокинов в сыворотке крови. Панель цитокинов включала: интерлейкин-1 бета (IL-1β), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-6 (IL-6), субъединицу растворимого рецептора интерлейкина-6 альфа (sIL-6Rα), интерлейкин-19 (IL-19), интерлейкин-20 (IL-20), интерлейкин-22 (IL-22), интерлейкин-26 (IL-26), интерлейкин-27 (IL-27), интерлейкин-28А (IL-28A), интерлейкин-29 (IL-29), интерлейкин-32 (IL-32), интерлейкин-34 (IL-34), интерлейкин-35 (IL-35). Результаты сравнивали с таковыми в контрольной группе.

На заключительном этапе проводили сопоставление уровней маркеров воспаления и цитокинов с параметрами НМГ.

Методы

Уровень гликированного гемоглобина А1с (HbA1с) и биохимические показатели сыворотки крови, в том числе вчСРБ, определяли на анализаторе AU480 (Beckman Coulter, США). Гематологические показатели исследовали на анализаторе ВС-5300 (Midray Medical International Limited, Китай). НЛС рассчитывали путем деления абсолютного числа нейтрофилов к абсолютному числу лимфоцитов. ИСИВ определяли как произведение количества тромбоцитов и абсолютного числа нейтрофилов, разделенное на абсолютное число лимфоцитов [22]. Концентрацию фибриногена в плазме крови измеряли на автоматическом анализаторе гемостаза ACL Elite Pro (Instrumentation Laboratory, США).

Концентрации IL-1β, IL-4, IL-6, sIL-6Rα, IL-19, IL-20, IL-22, IL-26, IL-27, IL-28A, IL-29, IL-32, IL-34, IL-35 в сыворотке крови определяли методом мультиплексного анализа цитокинов человека Bio-Plex Pro™ (Bio-Rad Laboratories, США). Мультиплексный анализ выполняли в соответствии с инструкциями производителя с помощью программного обеспечения Bio-Plex Manager 4.0.

Для НМГ использовали системы MMT-722 и MMT-754 (Medtronic, США). Калибровку систем осуществляли не менее четырех раз в день с помощью глюкометра One Touch Verio Pro+. Длительность НМГ составляла от трех до девяти дней (медиана — 6 дней). Расчет времени в диапазонах и параметров ВГ проводили с помощью программы экспертного анализа данных НМГ CGMEX2.

Этическая экспертиза

Исследование одобрено Этическим комитетом НИИКЭЛ — филиал ИЦиГ СО РАН (протокол №158 от 01.06.2020). Пациенты включались в исследование после подписания информированного согласия.

Статистический анализ

Поскольку распределение большинства параметров отличалось от нормального (проверка по критерию Колмогорова-Смирнова), применяли непараметрические методы. Количественные признаки описаны как медианы, 25-е и 75-е процентили. Достоверность межгрупповых различий оценивали по критерию Манна–Уитни. Для анализа ассоциаций применяли ранговый корреляционный анализ, многофакторный линейный регрессионный анализ. Статобработка проведена с помощью STATISTICA 10 (StatSoft Inc, 2011, CША).

Характеристика участников исследования

В исследование включено 174 мужчины и 296 женщин с СД1 в возрасте от 18 до 65 лет (медиана — 36 лет). Терапию в режиме многократных инъекций инсулина (МИИ) получали 328 человек, в режиме постоянной подкожной инфузии инсулина (ППИИ) — 142. При обследовании диагностированы: диабетическая ретинопатия (n=263), ХБП (n=299), полинейропатия (n=348), артериальная гипертензия (n=179), ишемическая болезнь сердца (n=25), хроническая сердечная недостаточность (ХСН) (n=79). Нормальную массу тела имели 276 человек, избыточную — 121, ожирение — 73.

Подгруппа пациентов с СД1, у которых были исследованы цитокины, включала 55 мужчин и 75 женщин. Инсулинотерапию в режиме МИИ получали 82 человека, в режиме ППИИ — 48. Спектр осложнений и ассоциированных состояний включал диабетическую ретинопатию (n=79), ХБП (n=71), полинейропатию (n=126), артериальную гипертензию (n=39), ишемическую болезнь сердца (n=7), ХСН (n=17). Нормальная масса тела была у 75 пациентов, избыточная — у 25, ожирение — у 30. Клинико-лабораторная характеристика пациентов представлена в табл. 1.

В контрольную группу вошли 27 человек с нормальной толерантностью к глюкозе, 12 мужчин и 15 женщин, от 22 до 57 лет (медиана — 32 года).

Маркеры воспаления

Значения маркеров воспаления в двух выборках больных СД1 приведены в табл. 1. Между уровнем вчСРБ и фибриногена прослеживалась положительная корреляция средней силы (r=0,52, р<0,0001). Оба маркера слабо коррелировали с расчетными индексами воспаления: НЛС (r=0,16, р=0,0005 и r=0,23, р<0,0001 соответственно) и ИСИВ (r=0,15, р=0,001 и r=0,25, р<0,0001). Уровни вчСРБ и фибриногена показали слабые положительные корреляции с возрастом (r=0,17, р=0,0002 и r=0,16, р=0,0005), длительностью СД (r=0,11, р=0,018 и r=0,15, р=0,001), индексом массы тела (ИМТ; r=0,38, р<0,0001 и r=0,33, р<0,0001), окружностью талии (ОТ; r=0,37, р<0,0001 и r=0,36, р<0,0001), уровнем триглицеридов (r=0,20, р<0,0001 и r=0,27, р<0,0001) и соотношением альбумин/креатинин мочи (r=0,11, р=0,018 и r=0,17, р=0,0002). Индексы воспаления с этими параметрами не коррелировали. Пациенты с ИМТ≥25 кг/м2, по сравнению с больными с ИМТ<25 кг/м2, имели более высокий уровень вчСРБ (2,12; 1,11–4,22 и 1,08; 0,52–2,05 мг/л, р<0,0001) и фибриногена (4,0; 3,3–4,6 и 3,4; 2,9–4,0 г/л, р<0,0001).

У больных с TIR<70% зафиксированы более высокие концентрации вчСРБ и фибриногена, более высокие значения ИСИВ, а также тенденция к более высоким значениям НЛС по сравнению с пациентами с TIR≥70% (р=0,018, р=0,026, р=0,037 р=0,101 соответственно, рис. 1). У пациентов с TAR≥25% концентрация вчСРБ была достоверно выше, чем у пациентов с TAR<25% (табл. 2). Значения обоих индексов воспаления также были выше у больных с TAR ≥25%, хотя межгрупповые различия были ниже статистической значимости. Не выявлено корреляций исследованных маркеров и индексов воспаления с уровнем HbA1c и параметрами ВГ.

В многофакторном линейном пошаговом регрессионном анализе с включением возраста, длительности СД1, ИМТ, TIR, TAR, CV, MAGE и MAG в качестве независимых переменных, а маркеров воспаления — в качестве зависимых ИМТ был независимым предиктором уровня вчСРБ (β=0,166, R2=0,04, р=0,0002) и фибриногена (β=0,299, R2=0,10, р<0,0001), в то время как MAGE показала независимую ассоциацию ИСИВ (β=0,123, R2=0,13, р=0,0001).

Цитокины в сыворотке крови

Цитокиновый профиль пациентов с СД1 характеризовался повышением концентраций IL-1β и IL-6 в сравнении с группой контроля. Концентрация IL-4 оказалась сниженной, а уровни IL-22 и IL-29 показали тенденции к снижению у больных СД1 (табл. 3). Пациенты с ИМТ≥25 кг/м2 по сравнению с больными с ИМТ<25 кг/м2 имели более высокие значения IL-1β (3,7; 2,8–4,4 и 2,9; 2,5–3,8 пг/мл, p=0,006), sIL-6Ra (9428; 7765–12862 и 7624; 5927–9894 пг/мл, р=0,04) и IL-32 (4,9; 0–23,4 и 0; 0–2,1 пг/мл, р=0,02). C ИМТ слабо коррелировали уровни sIL-6Ra (r=0,24, р=0,006) и IL-34 (r=0,25, р=0,004). Прослеживались слабые положительные корреляции между уровнем HbA1c и концентрациями IL-1β (r=0,26, р=0,003) и IL-6 (r=0,23, р=0,008).

У пациентов, достигших значений TIR>70%, отмечался более высокий уровень IL-4, а также меньшие концентрации IL-1β и IL-6, чем у больных с TIR≤70% (табл. 4). В ранговом корреляционном анализе величина TIR коррелировала с уровнем IL-1β (r=-0,29, р=0,0008), IL-4 (r=0,22, р=0,01), IL-6 (r=-0,28, р=0,001); TAR показала противоположные корреляции с этими цитокинами (IL-1β: r=0,33, р=0,0001; IL-4: r=-0,21, р=0,02; IL-6: r=0,29, р=0,0008). СV коррелировал c концентрацией IL-1β (r=0,28, р=0,001), IL-6 (r=0,36, р<0,0001), MAGE показала связи с IL-1β (r=0,25, р=0,004), IL-4 (r=-0,23, р=0,008), IL-6 (r=0,36, р<0,0001) и IL-29 (r=0,38, р<0,0001).

В моделях многофакторного линейного пошагового регрессионного анализа, включавших возраст, длительность СД1, ИМТ, TIR, TAR, CV, MAGE и MAG как независимые переменные, а концентрации цитокинов — как зависимые, величина TIR была отрицательно ассоциирована с уровнем IL-20 и IL-34, TAR была положительно ассоциирована c IL-1β, MAGE — c IL-26 и IL28A, MAG — с IL-29 (табл. 5).

В этом исследовании мы тестировали гипотезу о том, что патогенетическое действие ВГ у больных СД1 может реализоваться через воспаление низкой интенсивности и дисбаланс в продукции цитокинов. Для этого был проведен анализ ассоциаций между время- и амплитудо-зависимыми параметрами НМГ и уровнем маркеров воспаления низкой интенсивности (вчСРБ, фибриноген, НЛС, ИСИВ), а также концентрациями ряда цитокинов в крови. Среди последних нами были исследованы не только хорошо известные молекулы (IL-1β, IL-4, IL-6), но и цитокины, пока еще недостаточно изученные при СД (sIL-6Rα, IL-19, IL-20, IL-22, IL-26, IL-27, IL-28A, IL-29, IL-32, IL-34, IL-35). Для исследования цитокинов мы применили мультиплексный анализ, позволяющий одновременно анализировать большое количество молекул. Полученные результаты свидетельствуют, что на выраженность воспаления низкой интенсивности у больных СД1 оказывают влияние как время в гипергликемии, так и амплитудозависимые параметры ВГ, а также наличие избыточной массы тела и ожирения.

Репрезентативность выборок

Выборка пациентов является репрезентативной в отношении пациентов с СД1 молодого и среднего возраста, не имеющих терминальных осложнений заболевания и сопутствующих иммуновоспалительных заболеваний. Репрезентативность выборки определяется большим количеством пациентов (470 человек), применением относительно небольшого числа критериев исключения.

Сопоставление с другими публикациями

Хроническое воспаление рассматривается как важный патогенетический механизм в развитии диабетических осложнений. В исследовании EURODIAB было показано, что комбинированный индекс воспаления, включающий вчСРБ, IL-6 и фактор некроза опухолей-α, у больных СД1 ассоциирован с наличием ретинопатии, повышенной альбуминурии и сердечно-сосудистыми осложнениями [13]. Недавно показано, что НЛС у больных СД1 отражает выраженность атеросклероза сонных артерий [23]. Признаки иммунной активации и субклинического воспаления при СД1 наблюдаются не только на этапе аутоиммунной деструкции β -клеток, но и при длительном течении заболевания. Изучение протеома плазмы крови у больных с длительным СД1 показало ассоциацию воспалительных медиаторов с нефропатией и инсультом [24].

У обследованных нами пациентов наблюдалось повышение уровня провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-6 и снижение уровня противовоспалительного цитокина IL-4, что соотносится с концепцией воспаления низкой интенсивности при данном заболевании. Нами установлено, что выраженность воспаления низкой интенсивности (судя по уровню вчСРБ, фибриногена, ИСИВ, IL-1β и IL-6) выше у больных СД1, не достигающих значений TIR>70%. Величина TIR обратно коррелировала с концентрациями классических провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-6 и прямо коррелировала с уровнем противовоспалительного цитокина IL-4. Величина TAR демонстрировала противоположные взаимосвязи с этими параметрами. Эти данные дают дополнительное патогенетическое обоснование значимости TIR как индикатора гликемического контроля.

В данном исследовании нами впервые показана значимость амплитудозависимых индексов ВГ как предикторов воспаления низкой интенсивности у больных СД1. В частности, амплитуда колебаний уровня глюкозы (MAGE) показала независимую ассоциацию с ИСИВ и уровнями IL-26 и IL28A, а скорость изменений уровня глюкозы (MAG) — c концентрацией IL-29. Это согласуется с биоинформатическими и экспериментальными данными об активирующем влиянии чрезмерных флуктуаций глюкозы на экспрессию генов воспалительных медиаторов и уровень этих медиаторов в крови [8–11].

При анализе ассоциаций между ВГ и маркерами воспаления нельзя не учитывать другие факторы, способные модифицировать эти ассоциации. Одним из таких факторов является ожирение. Современные исследования фиксируют увеличение распространенности избыточной массы тела и ожирения среди больных СД1 [25]. Это в известной степени меняет клиническую феноменологию заболевания, сближая ее с СД2. Известно, что у больных СД2 уровень воспалительных медиаторов в крови в значительной степени зависит от сопутствующего ожирения и массы жировой ткани [26]. В данной работе нами показано, что больные СД1 с ИМТ≥25 кг/м2 имеют более высокий уровень вчСРБ, фибриногена, IL-1β, sIL-6Ra и IL-32 в крови по сравнению с пациентами с ИМТ<25 кг/м2. Ранее сообщалось, что уровень вчСРБ связан с ИМТ у детей и взрослых с СД1 [27][28]. Следовательно, ассоциация между избыточной массой тела, ожирением и субклиническим воспалением прослеживается и при СД1.

В данной работе мы исследовали у больных СД1 концентрации не только классических, но и относительно недавно идентифицированных интерлейкинов (IL-19, IL-20, IL-22, IL-26, IL-27, IL-28A, IL-29, IL-32, IL-34, IL-35). Предполагается участие некоторых из этих молекул в патогенезе СД1 [29]. Хотя мы обнаружили ассоциации некоторых из указанных цитокинов с параметрами ВГ, мы не получили однозначных данных об изменениях их уровней у больных СД1 в сравнении с контролем. Изучение роли «новых» цитокинов в патогенезе СД1, их связи с колебаниями гликемии, а также значимости их определения в контексте оценки воспаления и риска осложнений требуют дальнейших исследований.

Клиническая значимость результатов

Результаты исследования в очередной раз свидетельствуют о важности достижения целевых значений TIR у пациентов с СД1. Сокращение времени в гипергликемии (TAR) важно для предупреждения хронического воспаления — патогенетически значимого фактора сосудистых осложнений. Не менее важной задачей является поддержание нормальной массы тела у больных СД1, поскольку ожирение, как и гипергликемия, способствует развитию воспаления.

Ограничения исследования

Поскольку исследование одномоментное, мы не можем однозначно судить о причинно-следственных связях между признаками и их динамике. Обследование пациентов проводилось в условиях клиники. Это могло привести к смещению значений параметров ВГ относительно тех, что наблюдаются в реальной жизни пациентов. Длительность НМГ была относительно короткой, что определялось сроками госпитализации. 

Направления дальнейших исследований

Изучение влияния различных характеристик динамики уровня глюкозы на продукцию сигнальных и регуляторных молекул in vitro и in vivo является актуальной задачей для будущих исследований. Представляется перспективным изучение маркеров воспаления и цитокинов как маркеров развития и прогрессирования осложнений СД в проспективных исследованиях.

У больных СД1, имеющих нецелевые значения TIR (<70%), уровень маркеров воспаления низкой интенсивности (вчСРБ, фибриногена, ИСИВ) и сывороточных провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6) выше, чем у больных СД1 с TIR>70%. Кроме того, значения TIR отрицательно ассоциированы с уровнем IL-20 и IL-34. Амплитудозависимые параметры ВГ ассоциированы с выраженностью воспаления (величиной ИСИВ), уровнем IL-26, IL28A, IL-29. У больных СД1 с избыточной массой тела и ожирением наблюдаются более высокие уровни вчСРБ и фибриногена, чем у пациентов с ИМТ<25 кг/м2. Таким образом, гипергликемию, ВГ, избыточную массу тела и ожирение можно рассматривать как детерминанты воспаления низкой интенсивности при СД1.

Источники финансирования. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №20-15-00057-П).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов. Мавлянова К.Р. — сбор клинического материала, формирование базы данных, анализ данных НМГ, статистический анализ, написание текста; Семенова Ю.Ф. — сбор клинического материала, формирование базы данных, анализ данных НМГ; Орлов Н.Б. — исследование уровня цитокинов; Климонтов В.В. — концепция и дизайн исследования, анализ данных, написание текста. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

1 Доступен по ссылке: https://sd.diaregistry.ru/. Дата обращения: 08.04.2024.2 Козинец Р.М., Климонтов В.В., Бериков В.Б., Семенова Ю.Ф. Программа экспертного анализа данных непрерывного мониторинга глюкозы (CGMEX). Свидетельство о регистрации программы для ЭВМ RU 2021616872 от 16.04.2021 г.