COVID-19 представляет собой высококонтагиозное вирусное заболевание, возбудителем которого является РНК-вирус SARS-CoV-2 [1]. В дополнение к известной роли данного вируса в поражении дыхательной системы, известно и о COVID-19-ассоциированном повреждении эндокринных органов, включая островки Лангерганса поджелудочной железы (ПЖ) [2]. Однако патогенетические аспекты повреждения эндокринной части ПЖ в остром периоде COVID-19 остаются до конца неясными. Помимо описанного в литературе опосредованного цитокинового повреждения, а также нарушений, связанных с применением стероидов, рассматривается и возможное прямое цитотоксическое действие SARS-CoV-2 на эндокринный аппарат ПЖ [3][4].

В то же время, говоря о потенциальной интернализации вирусом эндокринной части ПЖ, описана идентификация SARS-CoV-2 методами иммуногистохимии, электронной микроскопии, а также гибридизации in situ [4][5]. Дополнительно была показана способность SARS-CoV-2 к инфицированию α- и β-клеток ПЖ, полученных из плюрипотентных стволовых клеток в ходе экспериментальных исследований [6].

Еще в 2003 г., в период вспышки тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного SARS-CoV, была обнаружена тропность вирусов Coronaviridae к островкам Лангерганса [7]. В качестве основных входных ворот вируса рассматриваются различные мембранные белки-переносчики, среди которых ключевая роль в литературе отводится ангиотензин-превращающему ферменту 2 (ACE2). На сегодняшний день в научном сообществе нет окончательной позиции относительно экспрессии ACE2 в эндокринной части ПЖ. Так, по данным некоторых авторов, данный белок представлен как в экзокринной, так и в эндокринной части ПЖ [8], а D. Fignani и соавт. показали, что экспрессия АСЕ2 в большей степени характерна для β-клеток ПЖ, чем для остальных клеток островков Лангерганса [9]. Несмотря на отсутствие экспрессии ACE2 в эндокринной части ПЖ по данным других исследователей [10], было выдвинуто предположение, что низкая экспрессия ACE2 в β-клетках ПЖ не исключает их потенциального инфицирования SARS-CoV-2, так как может объясняться высокой синтетической функцией β-клеток [11]. Дополнительно, ACE2 также был выделен в перицитах сосудов ПЖ, что позволяет предположить локальное воспаление и ишемическое повреждение островков Лангерганса вследствие поражения микроциркуляторного русла [9]. Еще одним механизмом повреждения эндокринной части ПЖ, ассоциированным с АСЕ2, может быть снижение преобразования ангиотензина 2 в ангиотензин 1, что ведет к повышению внутриклеточной концентрации ионов кальция и, как следствие, апоптозу клетки [12].

Интерес представляет и другой мембранный рецептор, известный в качестве входных ворот для вируса, а именно дипептидилпептидаза-4 (DPP4) [13]. Учитывая роль данного рецептора в метаболических путях, регулирующих как воспаление, так и гомеостаз глюкозы, D.J. Drucker рассматривает DPP4 в качестве связующего патофизиологического звена между COVID-19 и сахарным диабетом (СД) 2 типа [14]. Дополнительно, по данным С. Steenblock и соавт., данный рецептор обнаружен как в эндокринной, так и в экзокринной части ПЖ, в том числе в ACE2-негативных клетках с идентифицированным SARS-CoV-2 [11].

С точки зрения клинических проявлений накапливается все больше данных о декомпенсации ранее известных нарушений углеводного обмена (НУО), а также впервые выявленной гипергликемии в остром периоде заболевания, вызванного как SARS-CoV, так и SARS-CoV-2 [15][16]. Несмотря на факт, что у большинства больных нарушение метаболизма глюкозы после атипичной пневмонии, вызванной SARS-CoV, носило обратимый характер, у части пациентов, включенных в проспективное исследование с периодом наблюдения в 12 лет, было отмечено 4-кратное повышение риска СД [16]. Пандемия COVID-19, по данным метаанализа, а также когортных исследований, также характеризуется повышенным риском развития СД в отдаленном периоде, что может рассматриваться как проявление постковидного синдрома [17–19].

Уточнить встречаемость НУО в постковидном периоде у больных, перенесших COVID-19 средней и тяжелой степени, без ранее диагностированных НУО, а также оценить экспрессию белков SARS-CoV-2 и его трансмембранных переносчиков ACE2 и DPP4 в эндокринной части ПЖ у больных COVID-19 в острый период заболевания.

В исследование включены больные, соответствующие критериям включения, госпитализированные для стационарного лечения в инфекционный стационар ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России (г. Санкт-Петербург) по поводу COVID-19 средней и тяжелой степени тяжести в период с ноября 2020 г. по август 2021 г.

Проведенное исследование состоит из двух частей (клинической и морфологической). Первая часть исследования представляет собой одноцентровое продольное проспективное исследование с включением больных в острый период COVID-19 средней и тяжелой степени с целью уточнения развития НУО в постковидном периоде у лиц, ранее не имевших СД и предиабета. Конечной точкой исследования являлось развитие НУО через 6–18 мес от момента перенесенного COVID-19.

Вторая часть является морфологическим исследованием с оценкой характера повреждения эндокринной части ПЖ в острый период COVID-19 у умерших больных.

Пациенты с диагнозом COVID-19, подтвержденным по данным мультиспиральной компьютерной томографии и методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Критерии исключения: указания в анамнезе на наличие НУО до госпитализации в инфекционный стационар с COVID-19, тяжелые соматические заболевания, а также беременность и лактация.

Из 187 больных COVID-19, госпитализированных в инфекционный стационар с известными анамнестическими, клиническими и лабораторными данными, в проспективное наблюдение были включен 141 пациент без указаний на наличие НУО в анамнезе на момент госпитализации. Повторное обследование больных проведено через 6–18 мес от момента госпитализации больных в инфекционный стационар.

Исходное обследование являлось стандартным для госпитализированного больного. Дополнительно после подписания информированного согласия были собраны образцы сыворотки и плазмы крови.

Обследование в динамике включало антропометрическое исследование: измерение роста, веса, расчет индекса массы тела (ИМТ) по формуле Кетле (кг/м²) = вес (кг) / рост² (м²). За прибавку массы тела в постковидном периоде принято увеличение показателя, более или равное 5% от исходного. Для оценки состояния углеводного обмена у всех участников был определен уровень гликированного гемоглобина (HbA1c), уровень глюкозы плазмы крови натощак. Для оценки функции бета-клеток и инсулинорезистентности у 106 больных был определен уровень инсулина плазмы крови, произведен перевод единиц измерения инсулина из пмоль/л в мкЕд/мл (1 пмоль/л×0,138 = 1 мкЕд/л) и рассчитан индекс инсулинорезистентности HOMA-IR (Homeostasis model assessment of insulin resistance) по формуле:

HOMA-IR = [уровень базального инсулина(мкЕд/мл) × глюкоза плазмы натощак (ммоль/л)]/22,5.

Наличие отклонений показателей углеводного обмена от нормальных значений оценивалось в соответствии с критериями Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (1999–2013 гг.), а также с критериями Американской диабетической ассоциации (АДА, 2020).

Уровни С-реактивного белка (СРБ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), ферритина, базального инсулина измерялись на автоматическом биохимическом анализаторе Cobas e411 Roche (Швейцария), референсные диапазоны: 0–5 мг/л, 133–225 Ед/л, 15–150 нг/мл, 17,8–173,0 ммоль/л соответственно.

Уровень HbA1c измерялся на анализаторе для определения HbA1c D-10 (BIO-RAD, Франция), референсные диапазоны (<6,0%).

Для всех пациентов была рассчитана суммарная доза глюкокортикостероидов (ГКС) за время госпитализации. Расчет эквивалентной дексаметазону дозы ГКС выполнен с помощью программного обеспечения Steroid Conversation Calculator [https://www.mdcalc.com/calc/2040/steroid-conversion-calculator].

Был исследован секционный материал 197 пациентов, умерших во время госпитализации в инфекционном стационаре, с подтвержденным диагнозом COVID-19 по данным мультиспиральной компьютерной томографии органов грудной клетки и методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Разделение на волны заболеваемости проводилось в соответствии с датами госпитализации.

Секвенирование образцов для определения штамма вируса было проведено в ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева»: 2-я волна — B.1.397 B.1.317; Alpha VOC (B.1.1.7) и AT.1 lineage; 3-я волна — B.1.617.2 lineage (Delta VOC).

При гистологическом исследовании ткани ПЖ были оценены следующие показатели: степень аутолиза, липоматоза и фиброза, наличие воспалительного инфильтрата, некроза, отложений в островках, расширенных протоков, белковых масс в протоках, размер островков и степень ядерного полиморфизма.

Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования были отобраны 20 пациентов (10 пациентов, проходивших лечение во 2-ю волну и 10 — в 3-ю). Антитела к SARS-Cov-2 spike protein (GeneTex, USA, кроличьи), DPP4 (Affinity Biosciences, Australia, кроличьи), ACE2 (Affinity Biosciences, Australia, кроличьи) и инсулину (Abcam, United Kingdom, мышиные) были использованы для проведения ИГХ. Для оцифровки изображения и морфометрии использовалась программа Aperio ImageScope 12.3.3. Для иммунофлуоресцентной микроскопии с двойной меткой использовались сочетания антител инсулин-SARS-Cov-2 spike protein, инсулин-DPP4 и инсулин-ACE2. Для флуоресцентной микроскопии и получения микрофотографий использовался микроскоп Leica DM4000B.

Для статистического анализа данных морфологического исследования использовалась программа Statistica v10. Статистическая обработка результатов клинической части исследования осуществлялась с использованием программы Jamovi, version 2.3.2 (Jamovi project, 2022, Сидней, Австралия). Данные представлены медианой и интерквартильным размахом (Me [Q1; Q3]). Для определения значимости различий между двумя независимыми группами использовался U-критерий Манна–Уитни для количественных признаков и χ² для качественных признаков. При проведении корреляционного анализа применялся коэффициент корреляции Спирмена. Уровень значимости был установлен на уровне р²<0,05.

На момент госпитализации пациенты подписывали информированное согласие для проведения дополнительного обследования, которое было одобрено локальным этическим комитетом (Выписка № 1011-20-02C из протокола заседания ЛЭК N° 0212-22 от 30.11.2020 г.).

Дополнительное соглашение для проведения проспективной части исследования одобрено этическим комитетом НМИЦ им. В.А. Алмазова (Выписка № 200212-22 из протокола заседания ЛЭК N° 0212-22 от 26.12. 2022 г.).

Морфологическая часть исследования выполнялась из материала больных, находившихся на стационарном лечении с диагнозом COVID-19, чья госпитализация закончилась летальным исходом. На момент госпитализации все пациенты подписывали стандартное информированное согласие на обследование и лечение в стационаре.

У 187 больных, проходивших лечение в инфекционном стационаре по поводу COVID-19 средней и тяжелой степени тяжести, оценены клинические, лабораторные и инструментальные данные. Из 187 пациентов у 141 человека не было НУО в анамнезе. Исходная характеристика больных, включенных в дальнейшее проспективное исследование, представлена в табл. 1.

В постковидном периоде в интервале от 6 до 18 мес после перенесенного COVID-19 (медиана визита составила 7 [ 6; 10] мес) был обследован 141 больной без указаний в анамнезе на НУО при поступлении в инфекционный стационар. По результатам обследования в постковидном периоде повышение уровня HbA1с более 6,5% было выявлено у 7 больных (4,9%), уровень глюкозы плазмы крови натощак, равный и превышающий 7,0 ммоль/л, был обнаружен еще у 2 обследованных (1,4%). У 38 (29,6%) больных уровень гликемии и/или HbA1с отклонялся от нормальных значений согласно критериям ВОЗ. Вместе с тем при использовании критериев АДА количество больных с НУО в виде предиабета было значимо больше и составило 84 (59,6%) человека. Данные о НУО в постковидном периоде представлены на рис. 1.

Результаты обследования больных в постковидном периоде представлены в табл. 2. Для сравнительного анализа в соответствии с критериями ВОЗ пациенты разделены на группы «Больные с НУО» и «Больные без НУО».

Как видно из представленных данных, больные с НУО были старше (р=0,024), чем больные с нормальным уровнем гликемии. Также среди этих больных чаще встречалась артериальная гипертензия (р<0,001). В постковидном периоде больные с НУО имели больший ИМТ по сравнению с больными без НУО, который соответственно составил 29,8 [ 26,3; 33,4] и 27,9 [ 25,7; 31,0] кг/м², однако по встречаемости ожирения и избыточной массы тела больные не отличались (р=0,105). У 60 больных (42,5%) выявлена прибавка массы тела, в том числе прибавка массы тела на 5% и более была установлена у 31 (22,0%) пациента. Однако количество лиц со значимой прибавкой массы тела не отличалось в исследуемых группах.

При оценке лабораторных параметров были выявлены различия по уровню базального инсулина (р=0,042) и значению индекса HOMA-IR (р=0,012) между группами. Значения индекса HOMA-IR у больных с НУО и пациентов с нормальным уровнем гликемии представлены на рис. 2. Необходимо отметить, что среди больных с НУО у 19 человек в постковидном периоде выявлено повышение индекса HOMA-IR, более или равное 2,7, что значимо чаще встречалось по сравнению с лицами с нормальным уровнем глюкозы (р=0,012).

С учетом выявленных в постковидном периоде НУО, дополнительно был проведен анализ течения острого периода COVID-19 для данных больных (табл. 3).

Как видно из представленных в табл. 3 данных, в остром периоде COVID-19 пациенты не различались по ИМТ (р=0,124). В то же время, при сопоставлении данных лабораторного исследования больных в остром периоде COVID-19, у больных с НУО был выше уровень СРБ (р=0,007), однако значения концентраций других острофазных белков были одинаковы (р>0,05). Необходимо отметить, что больные были сопоставимы по степени поражения легочной ткани и длительности госпитализации, а также суммарной дозе ГКС, полученной за время госпитализации (р=0,075).

Анализ уровня гликемии во время госпитализации позволил выявить более высокие максимальные значения концентрации глюкозы в плазме крови при случайном определении у больных с НУО по сравнению с больными с нормальным уровнем глюкозы в постковидном периоде: 10,0 [ 7,8; 12,9] ммоль/л и 8,4 [ 6,6; 10,8] ммоль/л (р=0,019) соответственно и более частую встречаемость гликемии выше 11,1 ммоль/л при случайном определении, чем у больных без НУО (р=0,032). При анализе терапии не было выявлено различий в дозах ГКС, получаемых больными за время госпитализации (р=0,075).

По результатам корреляционного анализа выявлена положительная связь между значением индекса HOMA-IR и ИМТ у больных как в остром (р<0,001; r=0,389), так и в постковидном периоде (r=0,412; р<0,001). Уровень HbA1с положительно коррелировал со значением ИМТ как в остром периоде COVID-19 (р=0,019, r=0,202), так и в постковидном периоде (r=0,242; р=0,004).

Медиана возраста умерших больных составила 73 [ 65; 82] года, среди исследуемой группы 86 были мужчинами (43,7%). При гистологическом исследовании ткани ПЖ у 43 пациентов выявлены признаки хронического панкреатита, вне обострения.

Получены отличия по частоте некроза ПЖ у пациентов, умерших во 2-ю и 3-ю волну госпитализации: фокусы некроза были выявлены у 6 из 129 пациентов 2-й волны (4,7%) и 8 из 81 пациента 3 волны (9,9%). Белковое содержимое в протоках ПЖ было обнаружено у 16 из 129 пациентов 2-й волны (12,4%) и 17 из 81 пациента 3-й волны (21%). Расширенные протоки выявлены у 23 из 129 пациентов 2-й волны (17,8%) и 16 из 81 пациента 3-й волны (19,8%).

Выявлена положительная корреляционная связь между возрастом пациента и степенью липоматоза, фиброза, суммарного показателя липоматоза и фиброза, а также степени хронического повреждения. Таким образом, липоматоз являлся не столько специфическим показателем альтерации ПЖ, сколько показателем дегенеративно-дистрофического процесса, прогрессирующего с возрастом.

При ИГХ-исследовании ткани ПЖ выявлено окрашивание клеток островков Лангерганса антителами к SARS-CoV-2 spike protein, DPP4 и ACE2. Доля к SARS-CoV-2 spike protein позитивных клеток островков Лангерганса пациентов 2-й волны составила 1,85 [ 0–15,4]%, 3-й волны — 11,1 [ 5,3–14,8]%. Доля ACE2 позитивных клеток островков Лангерганса пациентов 2-й волны: 0,4 [ 0–1,7]%, 3-й волны — 0%. Доля DPP4 позитивных клеток островков Лангерганса пациентов 2-й волны: 0,5 [ 0–0,8]%, 3-й волны — 0 [ 0–0,4]% (рис. 3). При сравнении значений не выявлено значимых различий в экспрессии SARS-CoV-2 spike protein, DPP4 и ACE2 между пациентами 2-й и 3-й волн. Экспрессия SARS-CoV-2 spike protein, DPP4 и ACE2 в экзокринной части ПЖ в среднем не превышала 1% клеток.

Дополнительно, произведено иммунофлуоресцентное исследование с двойной меткой, результаты которого позволили выявить ко-локализацию инсулина-SARS-CoV-2 spike protein, инсулина-DPP4 и инсулина-ACE2 (рис. 4).

На сегодняшний день накоплено и систематизировано большое количество данных, отражающих повышение риска и встречаемости НУО в постковидном периоде. Так, по данным метаанализа T. Zhang и соавт., включившего 40 млн участников и 200 000 случаев выявленного СД, отмечен повышенный в 1,62 [ 1,45–1,80] раза относительный риск развития СД после перенесенного COVID-19 в разные временные сроки [18]. Аналогичные результаты были получены в ретроспективном когортном анализе, проведенном в Германии и включившем данные 35 865 пациентов в постковидном периоде с медианой наблюдения 119 дней. Было выявлено, что у лиц с перенесенным COVID-19 наблюдалась повышенная заболеваемость СД 2 типа по сравнению с пациентами, перенесшими другие ОРВИ верхних дыхательных путей (15,8 против 12,3 на 1000 человеко-лет) [19]. Интересными представляются и данные проспективного исследования B.Y. Keerthi и соавт.: из ста пациентов без ранее известного СД в анамнезе в остром периоде COVID-19 у 42% были выявлены НУО, а в группе без НУО у 10,3% спустя 3 мес после выписки из стационара развился предиабет, а у 13,8% больных — СД 2 типа [20].

Говоря о результатах отечественных исследований, при проспективном наблюдении пациентов развитие СД через 52±2 недели после выписки из инфекционного стационара зарегистрировано у 7,24% всех обследованных больных без СД в анамнезе [21].

В настоящем проспективном исследовании при наблюдении в динамике спустя 6–18 мес после выписки у лиц без известных на момент госпитализации НУО отмечены случаи впервые выявленного СД 2 типа (6,3%), а также высокая встречаемость отклонений показателей углеводного обмена от нормальных значений как по критериям AДA (59,6%), так и по критериям ВОЗ (26,9%). Учитывая патогенез СД 2 типа, логично предположить, что для больных с НУО должна быть характерна инсулинорезистентность. Однако, несмотря на более высокий уровень базального инсулина и значение индекса HOMA-IR у пациентов с НУО, лишь у 40,4% из них индекса HOMA-IR превышал 2,7, а у остальных 60% показатель находился в пределах нормальных значений. Учитывая тот факт, что у больных с последующим появлением НУО степень тяжести COVID-19, длительность госпитализации и даже суммарная доза ГКС не отличались от данных показателей у лиц с нормальным уровнем глюкозы, целесообразен поиск дополнительных механизмов развития гипергликемии.

В связи с этим, был проанализирован морфологический материал пациентов, умерших в острый период COVID-19. Полученные нами результаты свидетельствуют об экспрессии SARS-CoV-2 spike protein в эндокринной части ПЖ и подтверждаются мировыми данными. Так, SARS-CoV-2 был идентифицирован в островках Лангерганса не только ИГХ-методом, но и с помощью методов RT-PCR, электронной микроскопии и гибридизации in situ [4][5][22]. В то же время на сегодняшний день нет окончательной позиции относительно экспрессии ACE2 и DPP4 и других составляющих рецепторного аппарата, способствующих интернализации эндокринной части ПЖ вирусом [8–11][23]. Согласно полученным нами данным, экспрессия трансмембранных переносчиков ACE2 и DPP4 в островках Лангерганса была представлена минимально. В то же время, выявленная ко-локализация SARS-CoV-2 spike protein и его белков-переносчиков с инсулином позволяет предположить интернализацию именно эндокринного аппарата ПЖ вирусом.

Важно отметить, что все больше внимания уделяется роли и других рецепторов, выступающих в роли кофакторов для АСЕ-2 зависимого механизма проникновения вируса в клетку, а именно трансмембранной протеазе серина 2 типа (TMPRSS2), трансферриновым рецепторам (TRFC и нейропилину 1 (NRP1). Данные трансмемебранные рецепторы экспрессируются в β-клетках, по данным ряда авторов [11][24], что может объяснять тропность SARS-CoV-2 к эндокринному аппарату ПЖ.

Ассоциированное прямое цитотоксическое повреждение β-клеток, возможно, сказывается на их секреторной функции и обеспечивает отсутствие выраженной гиперинсулинемии в постковидном периоде.

Таким образом, полученные нами результаты подтверждают ранее опубликованные зарубежными авторами, свидетельствующие об экспрессии белков вируса SARS-CoV-2 в ПЖ, и апоптозе β-клеток, ассоциированном с прямым поражением эндокринного аппарата [7][8][9]. Дополнительно к вышесказанному, иммунологические сдвиги и гиперцитокинемия, характерные для острого периода COVID-19, могут представлять собой дополнительные важные факторы, приводящие к развитию инсулинорезистентности, гиперстимуляции β-клеток с последующей их дисфункцией [25][26]. Однако механизмы повреждения островков Лангерганса при новой коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2, остаются до конца не изученными и требуют проведения дальнейших исследований.

Одним из ограничений исследования можно считать отсутствие данных об уровне HbA1c в острый период COVID-19, а также концентрации инсулина в сыворотке крови до начала и на фоне терапии ГКС. Дополнительно, в данном исследовании в постковидном периоде не проводился пероральный глюкозотолерантный тест, использование которого могло повлиять на показатели встречаемости НУО.

Полученные в ходе проведенного исследования данные указывают на высокую встречаемость НУО в отдаленном периоде COVID-19, патогенез которых, вероятно, имеет многофакторный характер и требует детального изучения. В частности, развитие нарушений метаболизма глюкозы может быть обусловлено как прямым цитотоксическим действием SARS-CоV-2, так и иммунопосредованной гиперстимуляцией β-клеток с развитием в последующем их дисфункции. Дополнительно, нельзя исключить и вклад терапии ГКС в развитие инсулинорезистентности и глюкозотоксичности, что диктует необходимость проведения дальнейших проспективных исследований с целью усовершенствования подходов комплексной терапии COVID-19.

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Соглашение № 075-15-2022-301 от 20.04.2022).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов. Каронова Т.Л. — разработка концепции исследования, финальное редактирование текста; Митрофанова Л.Б. — разработка концепции исследования, анализ морфологичсексого материала, редактирование текста; Михайлова А.А., Лагутина Д.И., — сбор литературного материала, сбор и анализ научного материала, написание текста; Воробьева О.М. — сбор и обработка научного материала, написание текста; Воробьева О.М. — сбор и обработка гистологического материала, морфометрия, статистический анализ написание текста; Григорьева Д.О., Стерхова К.А. — морфометрия; Малько В.А., Михеева А.Г. — сбор научного материала, написание текста; Шляхто Е.В. — разработка концепции исследования.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы