Одним из тяжелых осложнений сахарного диабета (СД) является диабетическая нейроостеоартропатия (ДНОАП, стопа Шарко), которая достаточно часто приводит к развитию грубых деформаций стопы, следствием которых могут стать трофические язвы и ампутации. Это состояние характеризуется прогрессирующей деструкцией костей и суставов на фоне неврологического дефицита [1].

В различных литературных источниках распространенность ДНОАП колеблется от 0,8 до 4% [2][3].

Генез данного осложнения до конца не изучен. Считается, что нераспознанная травма или оперативные вмешательства на фоне выраженной неврологической дисфункции провоцируют формирование ДНОАП. Принято выделять две основные теории развития данного заболевания: нейроваскулярная и нейротравматическая, однако ни одна из них не дает полного понимания механизма развития патологических процессов при ДНОАП [4].

Имеются данные о негативном влиянии конечных продуктов гликирования (AGE) на развитие различной патологии, в том числе и поздних макро- и микрососудистых осложнений СД, однако работ, посвященных роли AGE в генезе костно-суставных поражений, крайне мало. Для более глубокого изучения патофизиологических механизмов возникновения ДНОАП вызывает интерес оценка уровня AGE в сыворотке крови пациентов с данным осложнением и без него.

AGE образуются в результате реакции, протекающей без участия ферментов между восстановленными углеводами (рибоза, глюкоза, фруктоза и др.) и свободными аминогруппами белков, липидов и нуклеиновых кислот живого организма.

Образование AGE — процесс, который требует длительного времени, в связи с чем белки с длительным периодом полураспада подвержены большему их накоплению. К таким белкам относятся коллаген и эластин. У пациентов с СД нарушены механизмы внутриклеточного протеолиза, и это ведет к еще большему накоплению AGE в клубочках почек, сетчатке глаза и периферических нервах [5][6].

AGE учувствуют в процессах воспаления посредством взаимодействия с их рецепторами (RAGE). RAGE являются трансмембранными гликопротеидами 1 типа и экспрессируются в различных клетках живого организма (макрофагах, лимфоцитах, клетках эндотелия), обуславливая развитие воспаления. В литературе встречаются данные о наличии RAGE в остеоцитах. При избыточном накоплении AGE и их взаимодействии с рецепторами происходит чрезмерное образование активных форм кислорода, приводящее к оксидативному стрессу [7].

Защитой от активных форм кислорода в организме выступают антиоксидантные ферменты, к которым относятся глутатионпероксидазы — семейство селензависимых ферментов. Одна из наиболее распространенных форм фермента — глутатионпероксидаза 1, которая встречается в цитоплазме всех тканей. Она участвует в восстановлении пероксида водорода и органических гидропероксидов, тем самым защищая белки от окислительной атаки [8].

Учитывая прогрессивный рост заболеваемости СД, а следовательно, и рост его осложнений, оценка AGE вызывает особый интерес для более глубокого изучения патофизиологических механизмов формирования, прогрессирования и рецидивирования ДНОАП.

Изучить уровень AGE и рецепторов к ним у пациентов с ДНОАП и без нее, но с диабетической полинейропатией и деформациями стоп.

Место проведения.

ФГБУ «НМИЦ эндокринологии», отделение диабетической стопы.

Время исследования.

Сбор материала проводился с ноября 2020 по май 2022 г.

Всего в исследование были включены 88 пациентов с диагнозом СД 2 типа (СД2). Больные были разделены на 2 группы. В 1 группу (n=43) были включены пациенты с СД2 и ДНОАП, во 2 группу (n=45) — лица с СД2 без данного осложнения.

Критерии включения пациентов в 1 группу:

Критерии включения пациентов во 2 группу:

Критерии невключения.

Выборка формировалась путем сплошного включения наблюдений, другая — подбором пар к наблюдениям первой выборки.

Работа выполнена в дизайне наблюдательного одноцентрового одномоментного контролируемого нерандомизированного исследования.

Исследование проведено в многопрофильном специализированном эндокринологическом стационаре (отделение диабетической стопы ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России). У больных выполнялся забор венозной крови натощак с последующим ее центрифугированием и получением сыворотки и плазмы. Исследование биообразцов крови выполнено в клинико-диагностической лаборатории того же учреждения. У всех включенных в исследование пациентов были определены AGE.

Образцы костной ткани были взяты во время плановых оперативных вмешательств по поводу деформаций стопы вследствие ДНОАП (группа 1) и хирургической обработки ран у лиц с нейропатической формой синдрома диабетической стопы (группа 2). Исследование костной ткани выполнено на кафедре патологической анатомии Сеченовского университета (зав. кафедрой профессор д.м.н. Коган Е.А.).

Все лабораторные исследования образцов сыворотки крови проводились в клинико-диагностической лаборатории ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России.

Определение исследуемых параметров осуществляли методом иммуноферментного анализа ELISA с использованием тест-систем в соответствии с инструкциями производителя. Минимальный детектируемый уровень для AGE (G-Biosciences, USA) составил 0,188 нг/мл.

Костный материал фиксировали в 10% растворе формалина. Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проведено на иммуностейнере Leica BOND-MAX (Германия) по стандартному протоколу. В качестве первичных антител для ИГХ-исследования использовались кроличьи поликлональные антитела к специфичному RAGE (титр разведения 1:50, Cloud-Clone Corp., США_. При выполнении ИГХ-исследования одновременно с основными реакциями ставились позитивные и негативные контрольные реакции. Исследование и фотографирование ИГХ-микропрепаратов проводилось на микроскопе Olympus BX46 кафедры патологической анатомии.

Статистический анализ проведен с использованием программного пакета Statistica 13, разработанного компанией StatSoft (США). Для описания количественных признаков были использованы медианы, первый и третий квартили, представленные как Me [Q1; Q3], а для качественных признаков — абсолютные и относительные частоты, выраженные в виде n/N (%). Сравнение двух независимых групп в отношении количественных признаков выполнено при помощи критерия Манна–Уитни (U-тест). Для сравнения частот бинарных признаков применен критерий Хи-квадрат (χ²). Корреляционный анализ количественных параметров проведен с использованием метода ранговой корреляции по Спирмену, а для оценки корреляции между порядковыми и количественными признаками был использован метод ранговой корреляции по Кендаллу. Значимость статистических гипотез проверялась при критическом уровне значимости (р) 0,05. При выполнении множественных сравнений была использована поправка Бонферрони (Р0), корректирующая критический уровень значимости. Все значения, находящиеся в диапазоне от критического значения до 0,05, были рассмотрены в качестве статистической тенденции.

Локальный этический комитет при ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» МЗ РФ постановил одобрить возможность проведения данной научно-исследовательской работы, выписка из протокола № 19 от 25.11.2020 г. Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие для участия в исследовании.

В исследовании всего приняли участие 88 пациентов. Из них были выделены две группы. В 1 группу входили пациенты с СД2 и ДНОАП (43), 2 группа (контрольная) состояла из пациентов с СД2 и с нейропатическими язвенными дефектами стопы без ДНОАП (45).

Исследуемые группы были сопоставимы по возрасту, длительности диабета и уровню его контроля. Клинико-лабораторная характеристика пациентов, включенных в исследование, представлена в табл. 1.

Всем пациентам был выполнен анализ крови на AGE.

Медиана AGE в группе без ДНОАП составила 219 [ 197; 271], а в группе с ДНОАП — 210 [ 168; 264] (табл. 2).

Статистически значимых различий по уровню AGE (p=0,258) между двумя группами обнаружено не было.

У 10 пациентов из каждой группы в ходе планового оперативного вмешательства (в 1 группе — реконструктивные операции по коррекции деформации стопы, во 2 группе — в ходе хирургической обработки хронического раневого дефекта при нейропатической форме синдрома диабетической стопы) производился забор интактного костного фрагмента для оценки экспрессии рецепторов к AGE в костной ткани ИГХ-методом.

В ходе ИГХ-исследования было зафиксировано достоверное увеличение относительного содержания RAGE в группе пациентов с ДНОАП по сравнению с группой контроля (p<0,05) (рис. 1).

У пациентов с повышенной экспрессией RAGE в костях (пациенты с ДНОАП) было выявлено более высокое содержание AGE в крови по сравнению с группой без данного осложнения (табл. 3).

На рис. 2 представлена ИГХ-картина экспрессии RAGE в костях у лиц с ДНОАП и группы контроля.

Однако при статистическом анализе их к общему числу пациентов (88 пациентов) статистически значимых различий по уровню AGE в крови обнаружено не было. (табл. 4).

Лабораторное исследование креатинина с последующим расчетом скорости клубочковой фильтрации (рСКФ) выполнялось всем пациентам. Уровень AGE статистически значимо отрицательно коррелировал с рСКФ (r=-0.341; р=0,001, метод Спирмена) (табл. 5).

Исследование AGE сыворотки крови у пациентов с ДНОАП проводится впервые, в связи с чем сопоставление с другими публикациями затруднительно.

Известно, что основными факторами, приводящими к поражению нижних конечностей при СД, являются нейропатия и ангиопатия. Доказано, что длительная и стойкая гипергликемия приводит к активации многоэтапного каскада метаболических нарушений, в результате чего развиваются сосудистые осложнения. Одним из объяснений патологических поражений микрососудистого русла является процесс неферментативного гликозилирования белков. Есть работы, которые подтверждают влияние AGE на развитие микрососудистых осложнений.

Так, по данным нескольких исследований, у пациентов с диабетической нефропатией отмечалось повышение уровня пентозидина, наиболее часто определяемого AGE [9][10].

В исследовании, проведенном S. Sugiyama и соавт., была выявлена положительная корреляция пентозидина с креатинином в группе пациентов с СД, однако не было обнаружено различий в уровне пентозидина в сыворотке крови у пациентов с СД и без него [11].

В ходе нашего исследования также была зафиксирована статистически значимая отрицательная корреляция AGE с рСКФ (r=-0,341; р=0,001, метод Спирмена). Группы пациентов значимо не отличались по возрасту, длительности СД и степени его контроля. Также у всех больных исключено наличие признаков терминальной почечной недостаточности.

Настоящее исследование не показало статистически значимых различий в уровне AGE сыворотки крови у пациентов с ДНОАП и без нее. В своей работе мы оценивали суммарное количество всех AGE, однако в работах, выполненных зарубежными и отечественными коллегами, чаще всего оценивался один конечный продукт гликирования — пентозидин.

В исследовании P. Odetti и соавт. была выявлена положительная корреляция между уровнем пентозидина в сыворотке крови и его содержанием в кортикальном слое кости. Исследователи сделали вывод о том, что уровень пентозидина в сыворотке крови может быть предложен в качестве суррогатного маркера его содержания в кости [12].

Мы зафиксировали значимое повышение экспрессии RAGE в костях стопы у пациентов с ДНОАП по сравнению с группой контроля. У этих же лиц было обнаружено и более высокое содержание AGE в крови по сравнению с группой без данного осложнения. Однако при статистическом анализе их к общему числу пациентов статистически значимых различий по уровню AGE в крови обнаружено не было.

Исходя из вышесказанного, можно утверждать, что уровень AGE в периферической крови не может служить маркером формирования ДНОАП при СД2. Можно предположить, что повышенная экспрессия RAGE в костной ткани больных с ДНОАП может быть следствием генетической детерминированности, что требует дополнительных исследований.

Небольшой объем выборки и использование данных больных, сформированных в одном отдельном учреждении, могут не в полной мере отражать ситуацию на популяционном уровне. Включение большего количества пациентов и формирование большей выборки ограничиваются относительно невысокой распространенностью ДНОАП.

Впервые проведено исследование AGE и рецепторов к ним в сыворотке крови и костной ткани больных СД2 с ДНОАП и без данного осложнения. Полученные результаты свидетельствуют о влиянии AGE на развитие микрососудистых осложнений диабета и диктуют необходимость проведения дальнейших исследований для более детального понимания механизмов влияния AGE на развитие ДНОАП.

Источники финансирования. Работа проведена в рамках выполнения Государственного задания Минздрава РФ НИОКТР № 121021600232-4.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Токмакова А.Ю. — разработка дизайна исследования, написание статьи; Коган Е.А. — проведение иммуногистохимического исследования; Никанкина Л.В. — проведение биохимического исследования крови; Каландия М.М. — сбор клинического материала, его анализ, написание статьи; Зайцева Е.Л. — сбор клинического материала, его анализ, написание статьи; Галстян Г.Р. — разработка дизайна исследования, написание статьи.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

Благодарности. Авторы выражают благодарность сотрудникам отделения диабетической стопы ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России, врачам-лаборантам за помощь в подготовке и получении результатов для данной публикации.