При сахарном диабете (СД) изменяется количество факторов роста (ФР), которые участвуют в процессе заживления [1]. Следует отметить, что данных, объективизирующих дефицит ФР у пациентов с синдромом диабетической стопы (СДС), немного. В указанном аспекте в обзорных работах [2][3] обсуждается недостаточное количество инсулиноподобного ФР (ИФР), трансформирующего ФР β (ТФР-β), ФР нервов, тромбоцитарного ФР, сосудистого эндотелиального ФР (СЭФР) [4–6]. При этом к одному из существенных по своим негативным последствиям воздействий на процесс заживления хронических ран при СДС относится разрушающее действие протеаз, уровень которых у больных с СД значительно превышает нормальные показатели. Протеолизу подвергаются не только ФР, воздействующие на синтез и пролиферацию компонентов грануляционной ткани, но и рецепторы к ним [7][8]. Таким образом, эти биологически активные вещества становятся неактивными и процесс репарации язв замедляется.

Следует отметить, что большинство работ, изучающих особенности заживления хронических ран при СДС, выполняются в эксперименте и на острых ранах [2]. Между тем, несмотря на универсальность процесса заживления ран, хронические раны по многим параметрам значительно отличаются от острых. Кроме того, нельзя исключить, что молекулярный состав незаживающей раны длительностью несколько недель будет отличаться от такового в ране длительностью более 12 мес. Работ, оценивающих содержание ФР в ране в зависимости от длительности ее существования, нет.

Проведение сравнительного анализа экспрессии ФР и рецепторов к ним в хронических незаживающих язвенных дефектах разной длительности при синдроме диабетической стопы.

Место проведения. В исследовании приняли участие пациенты, обратившиеся за помощью в отделение диабетической стопы ГБУЗ «Эндокринологический диспансер Департамента здравоохранения города Москвы».

Время исследования. Были проанализированы образцы нейропатических язвенных дефектов больных с СДС в период с 01.2014 г. по 12.2018 г.

Критерии включения в исследование были следующими:

Одноцентровое сравнительное исследование.

Сплошной.

Всем пациентам при первичном обращении проводилось стандартное обследование состояния периферической чувствительности и магистрального кровотока [9]. Вибрационная чувствительность оценивалась при помощи биотезиометра на уровне 1-х плюснефаланговых сочленений обеих стоп. Полученные значения выражались в вольтах (В). Значения более 25 В соответствовали выраженной нейропатии. Состояние коленных и ахилловых рефлексов проводилось по стандартной методике с использованием неврологического молоточка. Для суммарной оценки состояния болевой, температурной, тактильной чувствительности, коленных и ахилловых рефлексов вычислялся нейропатический дисфункциональный счет (шкала НДС). Значения ≥14 баллов соответствовали выраженной нейропатии [10]. Состояние магистрального кровотока оценивалось при помощи пальпации тибиальных артерий с проведением ультразвуковой допплерографии и вычислением лодыжечно-плечевого индекса. По показаниям выполнялись ультразвуковое дуплексное сканирование артерий нижних конечностей и транскутанная оксиметрия пораженной стопы [9].

Местное лечение язвенных дефектов проводилось в соответствии со стандартами оказания помощи больным с нейропатической формой СДС и включало в себя назначение режима разгрузки пораженной конечности, иссечение окружающего рану гиперкератоза, промывание раствором антисептика, механическое удаление некротических масс, наложение перевязочного средства. В качестве перевязочных средств использовались мазевые повязки, содержащие 10% повидон-йод, в случае умеренно или обильно экссудирующих ран применялись покрытия, содержащие альгинаты или гидроволокна [9].

Морфологические методы исследования

Биопсийный материал забирался из краев и из центра раны после промывания ее физиологическим раствором и очищения от некротических масс. Скальпелем срезался верхний слой раны в объеме до 0,5 см3, фиксировался в 10% нейтральном растворе формалина и заливался в парафин. Серийные парафиновые срезы окрашивались гематоксилином и эозином.

Иммуногистохимические реакции ставились по общепринятой методике с демаскировкой антигенов в ретривере на серийных парафиновых срезах биоптата раны. Блокирование эндогенной пероксидазы проводилось 3% пероксидом водорода в депарафиновых срезах. В качестве первичных специфических антител использовались антитела к СЭФР (Mo anti-Hu, клон VG1, Dako) и рецепторам к нему (СЭФР_р; Rb anti-Hu, поликлональные, Abcam), ИФР (Rb anti-Hu, поликлональные, Abcam) и рецепторам к нему (ИФР_р; Mo anti-Hu, клон JWB902, LifeSpan BioSciences), ЭФР (Rb anti-Hu, поликлональные, Abcam) и рецепторам к нему (ЭФР_р; Mo anti-Hu, клон H11, Dako). Для визуализации результатов иммуногистохимической реакции использовалась система детекции N-Histofine® Simple Stain MAX PO (MULTI; Nichirei, Япония).

Результаты иммуногистохимических реакций оценивались качественно по количеству клеток, экспрессирующих ФР и рецепторы к ним, и количественно по проценту окрашенных клеток на 300 клеток одного вида, принятых за 100%, и выражались в баллах. В табл. 1 отражена оценка образца в баллах в зависимости от экспрессии того или иного ФР и рецепторов к нему.

Статистический анализ проводился с использованием программы SPSS, версия 17.0.

Непрерывные показатели представлены как средние со стандартным отклонением (M±SD), качественные величины — как абсолютное число с его процентным выражением (n, %). Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA применялся для сравнения групп с непрерывными значениями, критерий χ2 вычислялся при сравнении групп с номинальными переменными. Для выявления уровня межгрупповой значимости использовался post hoc множественный тест Tukey. Применение теста Tukey возможно только для сравнения групп с непрерывными значениями однофакторным дисперсионным анализом ANOVA. Для изучения возможного значимого взаимного влияния параметров выполнялся корреляционный анализ. Применялся коэффициент корреляции Пирсона. Разница считалась значимой при уровне p<0,05.

Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ГБУЗ «Эндокринологический диспансер Департамента здравоохранения города Москвы» (Протокол № 34 от 20.10.2013 г.).

Биоптаты из язвенных дефектов были разделены на 3 группы в зависимости от длительности существования ран: ≤90 дней (группа 1) — 63 образца; 91–365 дней (группа 2) — 17 образцов; >365 дней (группа 3) — 9 образцов. В табл. 2 приведены данные клинических параметров обследуемых групп.

Таким образом, сравнительный анализ выявил, что больные с разной длительностью язвенных дефектов были сопоставимы по таким клиническим характеристикам, как возраст, пол, тип СД и его длительность, уровень контроля углеводного обмена, наличие и степень тяжести периферической полинейропатии.

Сравнительный анализ экспрессии ФР и рецепторов к ним представлен в табл. 3 и 4, на рис. 1.

По данным, представленным в табл. 3, количество клеток, экспрессирующих ФР и рецепторы к ним, значимо выше в ранах с длительностью существования до 90 дней (3 мес).

Таким образом, по данным представленным в табл. 4 и рис. 1, в образцах ран, длительность существования которых не превышала 90 дней, экспрессия ФР и рецепторов к ним была значимо выше, чем в ранах большей длительности. Значимой разницы в количественных показателях экспрессии ФР и рецепторов к ним между ранами длительностью 91–365 дней и >365 дней не получено.

Для выявления взаимосвязи между экспрессией ФР и длительностью существования язвенного дефекта был выполнен корреляционный анализ зависимости между экспрессией ФР и их рецепторов и длительностью существования раны. Данные представлены в табл. 5.

Согласно данным корреляционного анализа, экспрессия СЭФР и рецепторов к нему, рецепторов к ИФР, ЭФР и рецепторов к нему имеет значимую отрицательную зависимость от длительности существования раны, т.е. чем меньше длительность существования раневого дефекта, тем больше экспрессия ФР и рецепторов к ним. На рис. 2 изображена экспрессия СЭФР в ране длительностью <90 дней (рис. 2а), от 91 до 365 дней (рис. 2б), >365 дней (рис. 2в). Отчетливо видна разница в количестве экспрессирующих СЭФР клеток в ранах разной длительности.

В проведенном исследовании выявлено, что экспрессия различных ФР и рецепторов к ним значимо выше в образцах язвенных дефектов длительностью менее 3 мес. Это первая работа в мировой практике по оценке данного параметра в ранах различной длительности.

Для возможного объяснения полученных результатов следует обратиться к процессу заживления ран. Нарушение целостности кожных покровов, независимо от этиологии, проходит следующие стадии: воспаление, регенерация, эпителизация. При неосложненном течении длительность 1-й фазы (воспаление) не превышает 3–5 сут, 2-й (регенерация) — может достигать 30 дней, а 3-й (эпителизация) — растягивается на многие месяцы. Для адекватного процесса заживления патофизиологические механизмы, заложенные в каждой фазе, должны быть реализованы в полной мере. Так, для адекватного синтеза грануляционной ткани (2-я фаза) рана должна быть полностью очищена от микробных агентов в фазу воспаления. В ней должны присутствовать в необходимом количестве ФР и рецепторы к ним. При этом ведущая роль ФР в процессе заживления, особенно в фазе синтеза грануляционной ткани и эпителизации, не вызывает сомнения. Одним из источников большинства ФР являются активированные тромбоциты и клетки воспаления, в частности макрофаги, играющие ключевую роль как в 1-й фазе заживления, так и в инициации процессов синтеза грануляционной ткани в фазе пролиферации. Тромбоциты активируются и дегранулируются на ранних этапах процесса заживления в ответ на повреждение. Как уже указывалось выше, длительность фазы воспаления в норме не превышает 3–5 дней, но при хронизации процесса значительно удлиняется. С учетом полученных данных мы можем предположить, что тромбоциты, являясь одним из источников ФР, через длительный срок от момента возникновения раны уже не активны и не могут их синтезировать. Вторым важным продуцентом ФР являются макрофаги. При этом ФР вырабатывают макрофаги с фенотипом М2 [11][12]. Показано, что дисбаланс М1/М2 в сторону преобладания М1 приводит к хронизации процесса заживления и замедленной репарации [13][14]. Учитывая, что в исследуемых группах отмечается значительное превышение сроков заживления по сравнению с показателями в норме, можно сделать предположение о наличии у макрофагов дисбаланса М1/М2 и, как следствие, сниженного количества ФР. Таким образом, в ранах, существующих более 3 мес, уже нет эндогенных источников синтеза ФР. При этом речь идет не только о макрофагах, но и о компонентах грануляционной ткани (капиллярная сеть и фибробласты), которые в длительно существующих ранах замещаются фиброзом. Таким образом, чем дольше существует рана, тем меньше в ней сохраняются клетки, ответственные за синтез ФР, что и продемонстрировано в данной работе. Помимо значимо сниженного количества ФР, в ранах, существующих более 90 дней, крайне низкое содержание рецепторов к ФР, а в язвенных дефектах длительностью более 365 дней они (рецепторы к ФР) не определяются. В этой связи вызывает вопрос целесообразность назначения ФР для ускорения заживления таких ран.

Продолжительность существования язвенного дефекта до обращения за специализированной помощью является одним из ключевых параметров как исхода течения, так и сроков его заживления. В международных рекомендациях максимально быстрое обращение за специализированной медицинской помощью выделено в отдельный пункт, относящийся к профилактике ампутаций нижних конечностей. При этом следует отметить, что эта рекомендация основана в основном на мнении экспертов, а не на научно обоснованных доказательствах [15]. По нашим данным, длительность существования язвенного дефекта имеет принципиальное значение и оказывает статистически значимое влияние как на само заживление, так и на его сроки.

Полученные данные дают возможность сделать вывод о том, что содержание ФР и рецепторов к ним в нейропатических язвенных дефектах при СДС зависит от длительности существования хронической раны. Содержание таких факторов роста, как СЭФР, ИФР, ЭФР, и рецепторов к ним в язвенных дефектах продолжительностью до 90 дней статистически значимо выше, чем в хронических ранах, существующих более длительный срок. Выявленные различия позволяют объективизировать необходимость максимально быстрого обращения пациентов с СДС за специализированной помощью. Полученные различия могут значимо влиять на исход течения язвенного дефекта, сроки его заживления при назначении лечения в специализированном лечебном учреждении.

Источники финансирования. Исследование выполнено в рамках бюджетного финансирования учреждения.

Конфликт интересов. Явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием статьи, нет.

Участие авторов. Комелягина Е.Ю. — концепция и дизайн исследования, сбор клинического материала, отбор пациентов, обзор публикаций по теме статьи, обработка и анализ полученных данных, написание текста; Анциферов М.Б. — концепция и дизайн исследования, редактирование, финальное утверждение рукописи; Коган Е.А. — концепция исследования, выполнение морфологических исследований, утверждение финальной рукописи; Жарков М.Е. — подготовка биопсийных материалов к выполнению морфологических исследований.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.