Изучить иммуногистохимические особенности костной ткани стопы у пациентов с СД 2 типа (СД2) и ДНОАП по сравнению с больными без данной костной патологии.

Место и время проведения исследования

ФГБУ «НМИЦ эндокринологии», отделение диабетической стопы, Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), кафедра патологической анатомии. Сбор материала проводился с октября 2019 по декабрь 2020 г.

Изучаемые популяции (одна или несколько)

В исследование включены 20 пациентов с СД2, которые были разделены на 2 группы. 1-ю группу составили больные СД2 с ДНОАП, 2-ю группу составили лица с СД2 без данного осложнения.

Критерии включения:

1. СД2;

2. возраст до 65 лет;

3. длительность СД2 менее 35 лет;

4. наличие ДНОАП (хроническая стадия).

Критерии невключения:

1. СД1;

2. наличие гиперпаратиреоза;

3. диабетическая нефропатия, хроническая болезнь почек 4–5-й ст.;

4. наличие острой стадии ДНОАП и остеомиелита (на основании данных анамнеза, клинической картины и результатов рентгенографии и МРТ).

В исследование были включены 20 пациентов. Первую группу составляли лица с СД2 и ДНОАП — 10 человек, 2-я группа (контрольная) была сформирована из пациентов с СД2 и нейропатической формой синдрома диабетической стопы без ДНОАП — 10 человек. Все пациенты были госпитализированы в клинику ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России в плановом порядке для проведения хирургического лечения по поводу выраженной деформации стопы, обусловленной хронической стадией ДНОАП, или нейропатической формы синдрома диабетической стопы.

Диагностика хронической стадии нейроостеоартропатии основывалась на оценке состояния периферической иннервации (определение периферической чувствительности и сухожильных рефлексов по стандартной методике), оценке рентгенологической и МРТ-картины (отсутствие очагов остеолиза и отека костного мозга). Раневые дефекты у больных этой группы отсутствовали.

Диагноз нейропатической формы синдрома диабетической стопы у пациентов 2-й группы базировался на клинической картине (наличие длительно незаживающего раневого дефекта плантарной поверхности, Wagner 2–3), результатах оценки артериального кровотока (дуплексное сканирование артерий нижних конечностей) и периферической иннервации, данных рентгенографического исследования (отсутствие остеолиза).

Способ формирования выборки из изучаемой популяции (или нескольких выборок из нескольких изучаемых популяций)

Выборка формировалась путем сплошного включения наблюдений, другая — подбором пар к наблюдениям первой выборки.

Дизайн исследования

Работа выполнена в дизайне наблюдательного одноцентрового одномоментного контролируемого нерандомизированного исследования.

Для морфологического исследования использовали следующий биопсийный материал:

Описание медицинского вмешательства (для интервенционных исследований)

Пациентам в ходе оперативного вмешательства (в 1-й группе — реконструктивные операции по коррекции деформации стопы, во 2-й группе — в ходе хирургической обработки хронического раневого дефекта) производился забор интактного костного фрагмента объемом около 1 см3. Наличие остеомиелита в образце кости было исключено как клинически (в ходе операции выполнялся забор интактной кости, не имеющей связи с раневым дефектом), так и морфологически в ходе гистологического и иммуногистохимического исследования.

Методы

Материал фиксировали в 10% растворе формалина. Морфологический анализ костной ткани включал гистологическое исследование биоптатов костной ткани.

Для светооптического изучения образцы кости фиксировали в 2% растворе глутарового альдегида на 0,13 М какодилатном буфере и декальцинировали в смеси Na2-ЭДТА и 2% глутарового альдегида на том же буфере. Материал заключали в парафин. Проводили гистологическую оценку соотношения клеток костной ткани (остеобластов, остеокластов и остеоцитов) и их функционального состояния. Для этого готовили парафиновые срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Количественное соотношение клеток считали с помощью окулярной сетки Г.Г. Автандилова. При оценке состояния волокнистых структур учитывали их толщину, направленность и целостность, являющиеся морфологическими критериями их зрелости. Определяли преимущественный тип костной резорбции.

Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проведено на иммуностейнере Leica BOND-MAX (Германия) по стандартному протоколу. В качестве первичных антител для ИГХ-исследования использовались кроличьи поликлональные антитела к специфичному рецептору конечных продуктов гликирования (RAGE) (титр разведения 1:50, Cloud-Clone Corp., США), мышиные моноклональные антитела к PINP-терминальному пропептиду проколлагена I типа (клон C6, титр разведения 1:100, Cloud-Clone Corp., США) и PIIINP-терминальному пропептиду проколлагена III типа (клон H10, титр разведения 1:100, Cloud-Clone Corp., США). При выполнении ИГХ-исследования одновременно с основными реакциями ставились позитивные и негативные контрольные реакции.

Исследование и фотографирование гистологических и ИГХ-микропрепаратов проводилось на микроскопе Olympus BX46 кафедры патологической анатомии (зав. каф. — проф. Коган Е.А.).

Оценка экспрессии маркеров осуществлялась полуколичественным методом с помощью балльной оценки, где 1 «+» — слабо выражено, 2«+» — умеренно выражено, 3 «+» — сильно выражено, 4 «+» — очень сильно выражено.

Статистический анализ

Полученные в ходе проведения исследования результаты ИГХ-исследований обрабатывались методами описательной статистики (средние значения, стандартные ошибки средних, медианы, моды, стандартные отклонения). Значимость различий средних оценивалась при помощи непараметрического Т-критерия Уилкоксона. Различия считались значимыми при p<0,05.

Этическая экспертиза

Локальный этический комитет при ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» МЗ РФ постановил одобрить возможность проведения данной научно-исследовательской работы, протокол № 2 от 31.01.2018 г. Всеми пациентами подписаны информированные согласия на участие в исследовании.

Исследуемые группы пациентов с СД2 (1-я группа — 10 человек, 2-я группа — 10 человек) были сопоставимы по половозрастным характеристикам, длительности диабета и уровню его контроля.

В табл. 1 представлена клинико-лабораторная характеристика обследованных больных.

При лабораторном исследовании у пациентов как 1-й, так и 2-й группы признаков системного воспаления выявлено не было.

Микроскопическое исследование.

В биоптатах ткани пациентов с ДНОАП имелась костная и костномозговая ткань. В костной ткани — поля остеолизиса кости с врастанием в очаги разрушения грануляционной ткани с гиалинозом стенок микрососудов и набуханием эндотелия. Грануляционная ткань содержала выраженные воспалительные инфильтраты и склеротические изменения. В очагах остеолизиса обнаруживалось большое количество остеокластов (рис. 1А). В биоптатах пациентов контрольной группы также выявлялись фрагменты костной и костномозговой ткани без патологических изменений (рис. 1, Б).

Иммуногистохимическое исследование

PINP, PIIINP и КПГ обнаруживались в биоптатах ткани пациентов с ДНОАП, цитоплазме фибробластических элементов и клеток воспалительного инфильтрата грануляционной ткани, а также остеокластов в виде коричневой окраски цитоплазмы (рис. 2А, 3А, 4А).

В контрольной группе PINP, PIIINP и КПГ располагались в цитоплазме отдельных остеобластов и клетках костномозговой ткани, имеющих коричневое окрашивание цитоплазмы (рис. 2Б, 3Б, 4Б).

В ходе ИГХ-исследования было зафиксировано значимое увеличение относительного содержания рецепторов к PINP, PIIINP и КПГ в группе пациентов с ДНОАП по сравнению с группой контроля (p<0,05) (рис. 5).

Полученные морфологические и ИГХ-результаты исследования свидетельствуют о патологии коллагенообразования и, как следствие, о нарушении формирования и резорбции кости у пациентов с ДНОАП.

Репрезентативность выборок

ДНОАП — достаточно редкое осложнение СД, его распространенность, по данным различных литературных источников, колеблется от 0,16 до 18% среди всех пациентов с СД.

В исследование были включены пациенты, проходившие лечение в специализированном отделении диабетической стопы ФГБУ «НМИЦ эндокринологии».

Выборка репрезентативна, а полученные данные могут быть экстраполированы на общую популяцию.

Сопоставление с другими публикациями

Сопоставление с данными литературы затруднительно ввиду их отсутствия.

Полученные результаты исследования ИГХ-особенностей костного метаболизма у пациентов с СД2 и ДНОАП выполнены впервые.

Интересно, что в группе с ДНОАП определялась более активная экспрессия коллагенов I и III типов, в отличие от группы контроля.

На рис. 1–4 представлена ИГХ-картина биоптатов костных фрагментов у лиц с ДНОАП и группы контроля.

Таким образом, можно предположить, что активная перманентная травматизация и усиленный кровоток вызывают нарушение выработки и формирования коллагенов и интенсификации костного ремоделирования, что приводит к формированию ДНОАП.

Кроме того, в исследовании зафиксировано избыточное накопление КПГ в группе со стопой Шарко. Это может провоцировать дисбаланс формирования и резорбции кости у лиц с СД2 и служить прогностическим маркером формирования ДНОАП.

В исследовании D. Farlay и соавт. было отмечено, что пациенты с СД1 и повышенными значениями КПГ сыворотки крови имели более высокие риски переломов, чем пациенты с нормальными значениями КПГ крови [11].

Ввиду отсутствия морфологических исследований оценки накопления КПГ в костной ткани сопоставить полученные результаты с данными литературы не представляется возможным.

Клиническая значимость результатов

Полученные данные о повышении экспрессии PINP и PIIINP подтверждают предположение, что нарушение синтеза коллагена при СД2 может служить причиной формирования ДНОАП.

Кроме того, можно предположить, что повышенная экспрессия рецепторов КПГ у лиц с ДНОАП может быть следствием генетической детерминированности и являться прогностическим маркером формирования ДНОАП у лиц с СД2.

Ограничения исследования

Данное исследование было пилотным. Относительно невысокая распространенность ДНОАП ограничивает включение большого количества пациентов и формирование большей выборки. Требуется проведение дальнейших исследований на большей выборке.

Для определения прогностической значимости выявленных маркеров ДНОАП следует провести корреляцию с уровнями данных маркеров в сыворотке крови.

Направления дальнейших исследований

Следующим этапом исследования будет являться определение и изучение корреляций уровней PINP, PIIINP и КПГ в сыворотке крови и данных ИГХ-исследования.

Впервые проведено ИГХ-исследование маркеров костной резорбции и КПГ у лиц с ДНОАП. Полученные результаты свидетельствуют о нарушении коллагенообразования и, как следствие, о нарушении формирования и резорбции кости у пациентов с СД2 и ДНОАП: в группе 1 выявлено статистически значимое повышение экспрессии рецепторов PINP, PIIINP и КПГ.

Источники финансирования. Исследование выполнено в рамках НИР «Иммунологические, биохимические и гуморальные факторы и их роль в терапевтическом прогнозе при сахарном диабете 2 типа».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Токмакова А.Ю. — разработка дизайна исследования, написание статьи; Коган Е.А. — разработка дизайна исследования, проведение морфологического и ИГХ-исследования, микрофотографирование препаратов, написание статьи; Демура С.А.  — проведение морфологического и ИГХ-исследования, написание статьи; Жарков Н.В. — проведение ИГХ-реакций, статистика, написание статьи; Зайцева Е.Л.  — сбор клинического материала, его анализ, написание статьи; Каландия М.М. — сбор клинического материала, его анализ, написание статьи; Галстян Г.Р. — разработка дизайна исследования, написание статьи. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

Благодарности. Авторы выражают благодарность сотрудникам отделения диабетической стопы ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России, врачам-лаборантам и сотрудникам кафедры патологической анатомии ПМГМУ им. Сеченова (Сеченовский университет) за помощь в подготовке и получении результатов для данной публикации.