Изучить возможность использования в качестве маркеров прогноза развития СД2 ОНП rs13266634 гена SLC30A8, кодирующего трансмембранный белок-транспортер ионов цинка типа 8 и гена рецептора меланокортина-4 (MC4R) и оценить целесообразность их включения в модель рискометра по данному заболеванию.

Исходная популяционная выборка жителей 45–69 лет двух административных районов г. Новосибирска, типичных как для Новосибирска, так и для других крупных промышленных городов Сибири, сформирована в рамках международного проекта HAPIEE (Health, Alcohol and Psychosocial factors In Eastern Europe) в 2003–2005 гг. [22]. В течение 10 лет сотрудниками НИИ терапии СО РАМН (с 2017 г. «НИИТПМ-филиал ИЦиГ СО РАН») в наблюдаемой когорте проводился сбор данных о новых случаях СД2.

Общий объем выборки из генеральной совокупности определен протоколом проекта HAPIEE. C 2003 по 2005 гг. проведено обследование 9360 мужчин и женщин 45–69 лет. Отклик составил 61% [22]. СД2 устанавливали на основании информации, полученной от участников исследования, указавших на наличие у них СД2, а также лиц без истории СД2, у которых впервые определен уровень глюкозы плазмы натощак (ГПН) ≥7,0 ммоль/л (эпидемиологические критерии ВОЗ, 1999 г., ADA 1998 г.) [23]. Из настоящего анализа были исключены лица с установленным СД2 на базовом скрининге.

В программу обследования исходной репрезентативной выборки мужчин и женщин, сформированной в 2003–2005 гг., включены: регистрация социально-демографических данных, клиническое обследование, стандартный опросник по курению, антропометрия, измерение АД, исследование биохимических показателей сыворотки крови.

Одноцентровое наблюдательное когортное проспективное исследование. Сформированы 2 группы по принципу «случай–контроль». Группа «случай» — лица, у которых за 10 лет наблюдения выявлен новый случай СД2 на основе двух источников информации: при проведении повторного скрининга той же выборки в 2007–2008 гг. и на основе данных Новосибирского городского регистра СД2. «Контроль» — лица, сопоставимые по полу и возрасту, у которых за 10-летний период не развились нарушения углеводного обмена. В обеих группах на базовом скрининге проводились анализ данных структурированных опросников проекта HAPIEE, антропометрическое обследование, забор биологического материала для биохимических и молекулярно-генетических анализов.

При проведении мультивариантного логистического регрессионного анализа использовалась модель шкалы риска развития СД2, предложенная С.В. Мустафиной и соавт. У мужчин в конечный вариант модели риска СД2 в качестве независимых факторов риска вошли: глюкоза (Cut-off) ≥6,0 ммоль/л, ИМТ (Cut-off) ≥27 кг/м2, ЛПВП (Cut-off) ≥0,9 ммоль/л, ТГ (Cut-off) ≥1,4 ммоль/л, АД ≥150/90 мм рт.ст. У женщин в окончательную модель риска развития СД2 вошли предикторы, отличные от выявленных у мужчин: ОТ (Cut-off) ≥95 см, глюкоза (Cut-off) ≥5,7 ммоль/л, ТГ (Cut-off) ≥1,5 ммоль/л, АД ≥135/90 мм рт.ст., ИМТ (Cut-off) ≥32 кг/м2 [13].

Выделение ДНК из крови проводилось методом фенол-хлороформной экстракции. Выбор генов-кандидатов определялся известными данными о связи их полиморфизмов с СД2. Также при выборе генов-кандидатов учитывались возможные механизмы их реализации в патогенезе СД2. Детекцию полиморфизма rs13266634 гена SLC30A8 и полиморфизма rs17782313 гена MC4R проводили методом полимеразной цепной реакции с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов.

Для генотипирования rs13266634 гена SLC30A8 использовали праймеры: 5’-GTCAGAGCAGTCGCCCAT-3’(F) и 5’-CCTGGTCAACTGGAGATTCCA-3’. Амплификацию проводили в следующем температурном режиме: 33 цикла, включающих денатурацию 95°С 30 с, отжиг праймеров 56°С 30 с и элонгацию 72°С 30 с. Рестрикцию проводили с 5 ед. рестриктазы MspI («СибЭнзим», Новосибирск) с сайтом распознавания C↑CGG GGC↓C при 37°С в течение 16 ч. Детекцию продуктов амплификации и рестрикции осуществляли методом электрофореза в 4% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. Размер продукта амплификации составлял 171 п.н. После проведения рестрикции при генотипе ТТ детектировался продукт 101 п.н., 70 п.н., при генотипе СС — продукт 171 п.н., при гетерозиготном генотипе СT — продукты 171 п.н., 101 п.н. и 70 п.н.

Для генотипирования rs17782313 гена MC4R использовали модифицированную методику S. Abbas и соавт. (2015 г.) [12], праймеры: 5’-AAGCAGGAGAGATTGTATCT -3’(F) и 5’-GCTGAGACAGGTTCATAAAA-3’(R). Амплификацию проводили в следующем температурном режиме: 35 циклов, включающих денатурацию 95°С 30 с, отжиг праймеров 60°С 30 с, элонгацию 72°С 30 с. Рестрикцию проводили с 5 ед. рестриктазы Taq I («СибЭнзим», Новосибирск) при 37°С в течение 16 ч. Детекцию продуктов амплификации и рестрикции осуществляли методом электрофореза в 4% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. Размер продукта амплификации составлял 208 п.н. После проведения рестрикции при генотипе TT детектировался продукт 208 п.н., при генотипе CC — продукт 187 п.н., при гетерозиготном генотипе TC — 208 п.н. и 187 п.н.

Статистическая обработка проведена с использованием пакета статистических программ SPSS 16.0. Оценку соответствия частот генотипов равновесию Харди–Вайнберга проводили с использованием критерия χ2. Достоверность различий частот генотипов между группой СД2 и контрольной группой рассчитывали с использованием критерия χ2 по Пирсону и точного двустороннего критерия Фишера с поправкой Йейтса на непрерывность. В качестве уровня значимости использовали р<0,05. Для составления статистических моделей оценки риска применялась бинарная логистическая регрессия с функцией последовательного включения признаков. Выполнен анализ частот генотипов и аллелей изучаемых полиморфизмов генов (SLC30A8 и MC4R) в группе СД2 и группе контроля. Дополнительно эти частоты оценивались отдельно у мужчин и женщин в возрасте до 55 лет и 55 лет и старше. Также проведен мультивариантный логистический регрессионный анализ с включением исследуемых полиморфизмов генов и факторов риска (в виде непрерывных переменных) из модели, предложенной С.В. Мустафиной и соавт., отдельно для мужчин и женщин [13].

Проект HAPIEE одобрен этическим комитетом НИИ терапии СО РАМН (протокол №1, от 14.03.2001). Все обследованные давали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

Группа СД2 составила 443 человека (29,6% мужчин и 70,4% женщин), средний возраст на момент первого скрининга 56,2±6,7 года, с подтвержденным диагнозом нового случая СД2. В качестве контроля отобраны 532 человека (32,7% мужчин и 67,3% женщин) с отсутствием диабета, средний возраст 56,1±7,1 года.

Наблюдаемые частоты генотипов ОНП rs13266634 гена SLC30A8 и rs17782313 гена MC4R в контрольной группе соответствуют ожидаемым частотам согласно равновесию Харди–Вайнберга (χ2=0,52 и χ2=1,30 соответственно; табл. 1).

По частотам генотипов и аллелей полиморфизма rs17782313 гена MC4R не выявлено статистически значимых различий между группами, в том числе и при разделении по полу и возрасту (p>0,05); рис. 1.

Были построены многофакторные дисперсионные модели, где полиморфизм rs17782313 гена MC4R являлся детерминированной факторной переменной, возраст — ковариатой, а в качестве зависимых переменных были последовательно тестированы ИМТ, общий холестерин сыворотки крови, альфа-холестерин, холестерин ЛПНП, ТГ и индекс атерогенности (ИА), значения которых взяты из базы данных HAPIEE на момент первого скрининга. Проверка гипотезы об однородности дисперсий была проведена с помощью критерия равенства дисперсий (Levene’s test). По результатам анализа статистически значимыми оказались ИМТ (p<0,006), ИА (p=0,023) и ТГ (р=0,001). ИМТ, ИА, ТГ с учетом возраста оказались достоверно ниже у носителей генотипа TT полиморфизма rs17782313 гена MC4R по сравнению с носителями аллеля С.

При сравнении группы СД2 и контрольной группы по частотам генотипов полиморфизма rs13266634 гена SLC30A8 были найдены статистически значимые различия (p=0,027); рис. 2.

В результате данной работы не было обнаружено значимых различий доли гомозигот ТТ и гетерозигот СТ в группе СД2 по сравнению с контрольной группой (p=0,053 и p=0,476 соответственно). Было найдено значимое снижение доли гомозигот СС в группе СД2 (отношение шансов (ОШ) 0,575; 95% доверительный интервал (95% ДИ) 0,36–0,93; р<0,026). Таким образом, можно предположить, что гомозиготный генотип СC полиморфизма rs13266634 гена SLC30A8 является условно протективным в отношении СД2.

При сравнении групп, разделенных по полу, по частотам генотипов полиморфизма rs13266634 гена SLC30A8, статистически значимые различия были найдены только у женщин. Риск развития СД2 в 1,5 раза выше у женщин — носителей генотипа ТТ (ОШ 1,51; 95% ДИ 1,11–2,05; р=0,008) по сравнению с носителями двух других генотипов (табл. 2, рис. 3).

При сравнении групп СД2 и контрольной по частотам генотипов полиморфизма rs13266634 гена SLC30A8, разделенных по возрасту, не было найдено статистически значимых различий (p>0,05 в обеих группах). Однако при разделении групп по полу и возрасту были найдены статистически значимые различия у женщин 55 лет и старше (p=0,032); табл. 3, рис. 4.

В результате данной работы не было обнаружено значимых различий доли гомозигот ТТ и гетерозигот СТ полиморфизма rs13266634 гена SLC30A8 в группе СД2 по сравнению с контрольной группой у женщин 55 лет и старше (p=0,055 и p=0,455 соответственно). Было найдено значимое снижение доли гомозигот СС в группе СД2 женщин 55 лет и старше (ОШ 0,4; 95% ДИ 0,17–0,93; р=0,033).

Таким образом, можно сказать, что для женщин 55 лет и старше гомозиготный генотип СC является условно протективным в отношении СД2, а относительно генотипа ТТ различия хоть и статистически незначимы, но близки к пороговым.

При проведении мультивариантного логистического регрессионного анализа, включающего генотипы полиморфизма rs13266634 гена SLC30A8 в модель шкалы риска развития СД2, предложенной С.В. Мустафиной и соавт., использовались пороговые значения факторов риска [13]. При включении в модель полиморфизма rs13266634 гена SLC30A8 при мультивариантном логистическом регрессионном анализе сохранили свое прогностическое значение у мужчин ИМТ (р<0,001), у женщин — концентрация глюкозы в крови (р<0,001), ИМТ (р=0,014), ОТ (р<0,001), АГ (р=0,001), генотип СС сохранил свою прогностическую значимость у женщин (р=0,029). При аналогичном анализе с включением в рискометр rs17782313 гена MC4R сохранили свое прогностическое значение ИМТ (р<0,001) у мужчин, у женщин — концентрация глюкозы в крови (р<0,001), ИМТ (р=0,013), ОТ (р<0,001) и АГ (р=0,043); табл. 4.

Полученные данные о полиморфизме rs13266634 гена SLC30A8 согласуются с результатами других исследований. Ранее показано, что изменения в этом гене ассоциированы с развитием СД2 в нескольких популяциях [24–26]. В частности, в исследованиях отечественных ученых установлено, что наличие аллеля T повышает риск развития СД2 (OR=1,36), а наличие аллеля С уменьшает этот риск (OR=0,74) [27]. Ранее на базе используемой в данной работе выборки нами была проанализирована и изучена ассоциация полиморфизмов генов TCF7L2, FABP2, KCNQ1, ADIPOQ с прогнозом развития СД2 в Новосибирской популяции; исследование, описанное здесь, является продолжением упомянутой работы [21].

Связь этого полиморфизма с нарушениями регуляции глюкозы и СД2 была продемонстрирована в различных этнических группах с помощью GWAS [28–31]. Данные о связи полиморфизма rs13266634 гена SLC30A8 с СД2 противоречивы. Это может быть обусловлено расовыми, этническими, региональными различиями изучаемых популяций, разными подходами к формированию выборок и их анализу. Аллель C полиморфизма rs13266634 связан с нарушениями регуляции глюкозы и СД2 у китайского населения [32]. Изучение связи данного полиморфизма с СД2 в Индии продемонстрировало умеренное влияние полиморфизма rs13266634 гена SLC30A8 на предрасположенность к СД2 [33]. Множество метаанализов демонстрирует, что rs13266634 может быть важным генетическим фактором риска СД2 среди азиатских и европейских, но не африканских популяций [34][35]. Наше проспективное исследование подтвердило протективный эффект ОНП rs13266634 гена SLC30A8 относительно СД2 у женщин г. Новосибирска 55 лет и старше.

В нескольких исследованиях сообщалось, что ген рецептора меланокортина-4 (MC4R) является одним из причинных генов относительно СД2 [36][37]. В 2008 г. два GWAS сообщили об ассоциации полиморфизма rs17782313 около гена MC4R с ожирением [38][39]. Впоследствии ассоциация была подтверждена другими GWAS [40][41]. Полногеномные исследования показали, что ОНП rs17782313 вблизи гена MC4R связан с риском ожирения у европейцев и корейцев [38][42]. Поскольку ожирение связано с повышенным риском СД2, во многих исследованиях изучалась связь между полиморфизмом в районе гена MC4R и риском СД2 в различных этнических группах с противоречивыми результатами [43–45]. Так, rs17782313 показал связь с диабетом в нескольких исследованиях «случай-контроль» [46–48]. Обширный метаанализ, включающий 123 373 человека, подтвердил независимую от ИМТ значимую связь полиморфизма rs17782313 вблизи гена MC4R с риском СД2 в исследуемой популяции, состоящей из европейцев и азиатов [46].

Результаты ассоциации с СД2 ОНП, выявленных как вероятные маркеры СД2, уникальны относительно популяции г. Новосибирска, а также впервые проанализирована возможность включения изучаемых полиморфизмов генов в модель шкалы риска данного заболевания. Таким образом, полиморфизм rs13266634 гена SLC30A8 подтвердил вклад в развитие СД2 и может быть включен в рискометр СД2.

Необходимы дальнейшие исследования для изучения тонких механизмов связи гена MC4R с ожирением и СД2. В нашем исследовании полиморфизм rs17782313 вблизи гена MC4R не подтвердил свою ассоциацию с СД2 в исследуемой выборке жителей г. Новосибирска, в том числе при разделении групп по полу и возрасту. Однако была найдена ассоциация rs17782313 с ИМТ, что соответствует вышеупомянутым литературным данным.

Полиморфизм rs13266634 гена SLC30A8 подтвердил свою ассоциацию с прогнозом развития СД2 и может рассматриваться в качестве кандидата на внесение в генетический рискометр СД2. Разработаны варианты шкал риска для оценки прогноза развития СД2 у мужчин и женщин в возрасте 45–69 лет в течение 10 лет наблюдения. Ассоциация с прогнозом развития СД2 полиморфизма rs17782313 гена MC4R не обнаружена.

Источники финансирования. Проект HAPIEE поддержан грантами WT 064947/Z/01/Z; 081081/Z/06/Z; NIA, USA (1R01 AG23522). Настоящее исследование выполнено в рамках бюджетной темы по Государственному заданию № AAAA-A17-117112850280-2.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Мельникова Е.С. — сбор клинического материала, выполнение молекулярно-генетических исследований, обзор публикаций по теме статьи, написание текста рукописи, статистическая обработка результатов, анализ данных; Максимов В.Н. — концепция и дизайн исследования, анализ данных, предоставление реагентов/материалов/инструментов для анализа, редактирование статьи; Иванова А.А. — рецензирование черновика статьи, проверка критически значимого содержания; Рымар О.Д. — проверка критически значимого содержания, утверждение рукописи для публикации; Мустафина С.В. — проверка критически значимого содержания, утверждение рукописи для публикации; Щербакова Л.В. — статистическая обработка популяционного исследования, утверждение рукописи для публикации; Бобак М. — концепция базового проекта, проверка критически важного содержания, утверждение рукописи для публикации; Малютина С.К. — координация популяционного обследования, проверка критически значимого содержания, утверждение рукописи для публикации; Воевода М.И. — рассмотрение и одобрение проекта статьи. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

Благодарности. Авторы выражают глубокую признательность академику Юрию Петровичу Никитину за предоставленную возможность сформировать группы на материале когорты HAPIEE; а также статистикам Л.В. Щербаковой и Е.Г. Веревкину за подготовку баз данных.