Определение маркеров сосудистой кальцификации у пациентов, получающих лечение программным гемодиализом с СД2 и без СД.

Дизайн исследования

Проведено обсервационное одноцентровое проспективное выборочное нерандомизированное исследование на базе диализного центра ГКБ им. С.И. Спасокукоцкого.

Критерии соответствия

Критерии включения в исследование: пациенты с СД и без СД2, получающие лечение ПГ (сопоставимые по возрасту), с высоким сердечно-сосудистым риском.

Критериями исключения явились: СД 1 типа, психические заболевания, тяжелые инфекционные заболевания; острый ИМ в течение 2 мес до момента включения; ОНМК в течение 2 мес до момента включения, злокачественные новообразования, лейкоз; беременность, паратиреоидэктомия.

Условия проведения

Исследование проводилось на базе ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет). Набор пациентов проводился амбулаторно на базе диализного центра ГКБ им. С.И. Спасокукоцкого.

Продолжительность исследования

Исследование проводилось в течение 2016–2017 гг.

Описание медицинского вмешательства

Основная группа наблюдения включала 82 больных, из них 25 пациентов с СД2. Больные получали лечение ПГ (n=82), всем пациентам проводились процедуры гемодиализа 3 раза в неделю по 4,5 ч. Все участники исследования прошли комплексное обследование, включающее лабораторные и инструментальные методы исследования. Один раз в месяц проводился забор крови с целью определения общего анализа крови (гемоглобин); биохимического анализа крови (креатинин, мочевина, кальций общий, фосфор) и определение специфических маркеров сосудистой кальцификации (FGF23). Биохимические и гормональные показатели определяли в биохимической лаборатории ГКБ им. С.И. Спасокукоцкого на полуавтоматическом биохимическом анализаторе Multi+ (CORMAY, Польша). О нарушении фосфорно-кальциевого обмена судили по уровню интактного паратиреоидного гормона (иПТГ), определяемого методом иммунохимического анализа (допустимый уровень от 2 до 9 норм. значений при ХБП 5 ст. – 130–585 пг/мл) на анализаторе IMMULITE 2000XPi (Siemens Healthcare Diagnostics Inc, США). У всех больных изучен уровень в сыворотке крови FGF23 с использованием мультиматриксного иммуноферментного набора для количественного определения FGF23 (C-концевой фрагмент) человека в сыворотке, ЭДТА-плазме, гепаринизированной плазме и цитратной плазме. Исследование проводилось по стандартному протоколу специалистами диагностической лаборатории «Вералаб» на автоматическом иммуноферментном анализаторе "Lazurite" компании Dynex Technologies, Inc. (США). Для исследования у больных проводили забор крови в вакуумные пробирки, кровь центрифугировали и полученную сыворотку замораживали и хранили при температуре –28 °С. Стандартные рентгенологические исследования были использованы для количественной оценки степени кальцификации сосудов. Для выявления кальцификации выполнен переднелатеральный обзор брюшной полости и таза. На фотографии таза горизонтальная линия проходит вдоль верхних краев обеих головок костей таза, вертикальная – в середине позвоночного столба. Оценка степени выраженности кальцификации проводилась по полуколичественной балльной шкале от 0 до 8 баллов (0 – кальцификация отсутствовала, 1 – кальцификация была обнаружена на 1 из восьми изученных графиков, затем баллы для всех графиков суммировались). Для этого были использованы рентгенограммы тазовой области, каждая из которых была разделена двумя линиями на 4 секции. В нашей работе оценивались факт наличия и распространенность кальцификации брюшного отдела аорты (КБА) по результатам обзорной рентгенографии брюшной полости в боковой проекции, согласно шкале Kauppila. Исходя из полученных результатов по баллам, кальцификация была условно разделена на легкую (до 6 баллов), среднюю (от 6 до 15 баллов) и тяжелую степени (до 24 баллов) [6].

Основной исход исследования

За первичную суррогатную точку принимали степень СК у больных на ПГ.

Этическая экспертиза

Проведение данного исследования было одобрено комитетом по этике Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (выписка из протокола №07-15 от 15.07.2015). Получено информированное согласие на участие в исследовании у всех пациентов.

Статистический анализ

Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программы SPSS18 for Windows (SPSS Inc., США) и программы для работы с электронными таблицами MS Excel 2013. Непараметрические данные представлены в виде медианы (Me) и перцентилей Q [25; 75]. Различия между группами выявляли по U-критерию Манна–Уитни. Корреляционную зависимость определяли с помощью линейного коэффициента Пирсона [r]. Статистически значимым считали до 5% уровня значимости (p<0,05).

Исследование было проведено у 82 пациентов на стадии ТПН (ХБП 5) (51 мужчина, 31 женщина), получающих лечение ПГ, из которых 27 человек, составивших основную группу (14 мужчин, 13 женщин), страдали СД2, и 55 человек (37 мужчин, 18 женщин), не болеющих СД, составили группу сравнения. В основной группе пациентов средний возраст составлял 67 лет [61; 75], в группе сравнения – 67 лет [57; 76]. Характеристика больных представлена в табл. 1. По основным параметрам между обследованными группами пациентов статистически значимых различий не отмечалось.

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов

Примечания: СД2 – сахарный диабет 2 типа; ГД – программный гемодиализ; иПТГ – интактный паратиреоидный гормон; р – достоверность.

Уровень FGF23 у пациентов на ПГ без СД составил 11 359 [7192; 26232] пг/мл, у больных СД2 – 10 173 [87 860; 13 866] пг/мл при р<0,135.

При оценке степени КБА в группе пациентов с СД2 легкая кальцификация выявлена у 27% пациентов, кальцификация средней и тяжелой степени – у 44% и 40% соответственно. У пациентов с ТПН без СД, напротив, у 40% пациентов отмечалась легкая степень кальцификации, тогда как кальцификация средней и тяжелой степени отмечалась в 25,5% и 34,5% случаев соответственно (р=0,05).

В исследовании оценивали корреляцию между выраженностью СК и параметрами фосфорно-кальциевого обмена у пациентов с СД2 и без СД. Отмечается положительная корреляционная связь между уровнем FGF23 и СК (r=0,429; p<0,001) и корреляционная связь между иПТГ и СК (r=0,477; p=0,025) (рис. 1), между фосфором неорганическим и СК (r=0,559; p<0,001) в группе пациентов с СД2. Таким образом, на основании полученных данных можно судить о том, что у пациентов в группе с СД2 кальцификация была более выражена и имела большую взаимосвязь с параметрами фосфорно-кальциевого обмена, что также указывает на роль гипергликемии.

Рис. 1. Взаимосвязь между уровнем интактного паратиреоидного гормона и сосудистой кальцификацией на программном гемодиализе у пациентов с сахарным диабетом 2 типа.

Нами отмечена положительная корреляционная связь между уровнями FGF23 и ПТГ в группе пациентов с СД2 (r=0,753; p<0,001) (рис. 2). Учитывая полученные данные, можно сделать вывод, что, несмотря на высокий уровень FGF23, направленный на подавление секреции ПТГ, развивается вторичный гиперпаратиреоз (ВГПТ), и уровни FGF23 прямо коррелируют с уровнями фосфора и кальция. Это, по-видимому, связано с наличием относительной резистентности паращитовидных желез к действию FGF23, таким образом, FGF23 может служить показателем развития резистентного ВГПТ при ХБП. Гиперфосфатемия коррелировала с обнаруженной нами кальцификацией сосудов по данным рентгенологического исследования (r=0,559; p<0,001). У больных, которых мы наблюдали, отмечалось повышение уровня фосфора. Можно предполагать, что нарушение фосфорно-кальциевого обмена и наличие СД2 способствуют формированию медиакальциноза в условиях ТПН.

Рис. 2. Взаимосвязь между уровнем интактного паратиреоидного гормона и фактором роста фибробластов 23 у пациентов на программном гемодиализе с сахарным диабетом 2 типа.

Также имеется положительная корреляция между длительностью ПГ и повышением уровня FGF23 (r=0,373; p=0,004) у пациентов с СД2 (рис. 3). Таким образом, можно судить о том, что FGF23 повышается при прогрессировании ХБП до развития ТПН, а, учитывая, что СД2 чаще приводит к развитию и прогрессированию ХБП, можно сделать вывод, что повышение FGF23 и прогрессирование кальцификации будут выше по сравнению с пациентами без СД. Нами также была выявлена положительная корреляционная связь между уровнем фосфора неорганического и случаями ОНМК (r=0,722; р=0,01), что связывают с повышением риска сердечно-сосудистых событий в группе пациентов без СД.

Рис. 3. Показатель взаимосвязи фактора роста фибробластов 23 и длительности диализного лечения у пациентов с сахарным диабетом 2 типа.

Как видно из представленной табл. 1, пациенты с СД2 имели небольшую продолжительность ПГ и менее выраженные нарушения фосфорно-кальциевого обмена, но СК при этом была более выражена и значимо коррелировала с основными параметрами фосфорно-кальциевого обмена (табл. 2).

Таблица 2. Взаимосвязь между выраженностью сосудистой кальцификации и параметрами фосфорно-кальциевого обмена у лиц на программном гемодиализе.

Примечания: ПГ – программный гемодиализ; СД2 – сахарный диабет 2 типа; СК – сосудистая кальцификация; ХБП – хроническая болезнь почек; иПТГ – интактный паратиреоидный гормон; r – коэффициент корреляции; р – достоверность

Установлено, что сердечно-сосудистые заболевания при ХБП в сочетании с СД2 встречаются в среднем в 20–35 раз чаще, чем в общей популяции [7, 8]. Современные научные исследования направлены на поиск значимых кардиоваскулярных маркеров. На основании результатов нашего исследования можно говорить о том, что изменения фосфорно-кальциевого обмена при ХБП –ВГПТ, гиперфосфатемия и эффекты FGF23, – все эти изменения могут являться триггерами для развития сердечно-сосудистой кальцификации, что, в свою очередь, ассоциируется с повышением риска смертности от сердечно-сосудистых заболеваний.

В развитии ВГПТ можно выделить несколько звеньев патогенеза: ретенция фосфатов, уменьшение концентрации кальция, потеря нормального подавления ПТГ, уменьшение синтеза и секреции кальцитриола, развитие резистентности к ПТГ. Дальнейшие исследования в области ВГПТ привели к новому открытию – FGF23 (fibroblast growth factor 23). По мере прогрессивного ухудшения функции почек отмечается повышение уровня FGF23. Точкой приложения FGF23 являются почки, где он уменьшает реабсорбцию фосфора, увеличивая его мочевую экскрецию, и ингибирует фермент 1-альфа-гидроксилазу, подавляя синтез кальцитриола. Кроме того, FGF23 напрямую участвует в регуляции синтеза ПТГ через рецепторы в околощитовидных железах. Увеличение продукции FGF23 длительно препятствует развитию гиперфосфатемии. Прогрессирование ХБП способствует формированию резистентности к действию FGF23 и возникновению стойкой гиперфосфатемии [8].

Гиперфосфатемия – доказанный независимый фактор риска развития сердечно-сосудистых осложнений у пациентов с ХПБ. Одной из наиболее распространенных причин гиперфосфатемии является ПН, леченная гемодиализом, при которой уровень неорганического фосфата в сыворотке крови обычно превышает 2 ммоль/л и ассоциируется с широко распространенной кальцификацией сосудов. Гиперфосфатемия ускоряет прогрессирование кальцификации и кардиальной патологии, что может объяснить корреляцию между кардиоваскулярной заболеваемостью у больных ХБП и уровнем фосфора [9], что было отмечено также и в нашем исследовании. Кроме того, была показана ассоциация уровня FGF23 с факторами риска сердечно-сосудистых событий, гипертрофией миокарда, эндотелиальной дисфункцией и атеросклеротическим поражением сосудов [10–12].

Развитие гиперфосфатемии и повышение уровня FGF23 – раннее и распространенное нарушение при ХБП. В исследованиях последних лет выявлена прямая взаимосвязь между уровнем FGF23, гиперфосфатемией, сосудистой кальцификацией и высоким риском смерти у пациентов с ХБП [13]. В российских исследованиях редко оценивалась роль этих маркеров у пациентов с СД2, однако было продемонстрировано, что FGF-23 является независимым фактором риска ХПН у пациентов с диабетической нефропатией [14].

Кальцификация медии артерий также связана с развитием артериосклероза и является характерной чертой СД2. В последние годы показано, что медиакальциноз является регулируемым и активным процессом (схожим с костной минерализацией), в котором принимают участие различные белки, связанные с костью. Гиперфосфатемия и гипергликемия изменяют фенотип клеток сосудистой стенки. Фосфор при его избытке в крови пациентов с ХБП при помощи натрий-зависимых транспортеров попадает в сосудистые гладкомышечные клетки (СГМК), где принимает участие в процессах минерализации сосудистых клеток. Высокий уровень фосфатов может усугублять механизмы кальцификации сосудов, опосредованные остеогенными факторами транскрипции. СГМК могут подвергаться остеогенной трансформации в фенотипически отличные остеобластоподобные клетки, которые способны экспрессировать и высвобождать остеохондрогенные белки. Увеличение концентрации фосфатов в СГМК индуцирует переход к остеобластоподобному фенотипу, особенно в состояниях избытка фосфора, как это было выявлено у наших пациентов (см. табл. 1). Остеогенно-праймированные СГМК экспрессируют щелочную фосфатазу и секретируют костеассоциированные белки, такие как остеопонтин, коллаген типа 1, остеопротегерин, костный морфогенный белок-2 и остеокальцин [15].

Вследствие данного процесса появляются обломки клеточных мембран и апоптозных телец, которые становятся первичным очагом отложения апатитов. Сочетание ХБП и СД2 способствует развитию тяжелых метаболических нарушений, ухудшая течение как самого СД2, так и ХБП [16], вызывая тяжелейшие изменения в сосудистой стенке, учитывая комбинацию таких факторов, как гипергликемия, изменения фосфорно-кальциевого обмена, и, как видно из нашего исследования, изменениям в сосудистой стенке больше подвержены пациенты с СД2. Отмечена положительная корреляция между СК и FGF23, кальцием, фосфором именно у пациентов с СД2, что также было показано и в ряде исследований. Barry и соавт. продемонстрировали связь между наличием СД, повышением концентрации FGF23 в плазме и кальцификацией коронарных артерий [17]. В исследовании Tamei изучались факторы риска аортальной кальцификации у пациентов, находящихся на ПГ, куда также были включены пациенты с СД2 [18]. По результатам исследования индекс кальцификации аорты был значительно выше у пациентов с СД2. В нашем исследовании была получена корреляция между выраженностью СК и FGF23 у пациентов в группе с СД2. Результаты нашего исследования соотносятся с литературными данными: у обследованных нами пациентов с ХБП были получены высокие уровни иПТГ, фосфора и FGF23, что также ассоциировалось с более выраженной кальцификацией сосудов в сравнении с пациентами без СД. Таким образом, несмотря на идентичные показатели фосфорно-кальциевого обмена (иПТГ, неорганический Ca и P, уровень FGF23 – см. табл. 1), нами выявлена выраженная СК, более значимо коррелирующая с уровнем иПТГ, неорганическим Р и FGF23 по сравнению с пациентами без СД (табл. 2).

Полученные различия в выраженности СК у пациентов с ПН на диализе, страдавших и не страдавших СД, могут быть связаны с гипергликемией, являющейся у больных с СД дополнительным фактором развития окислительного стресса. Окислительный стресс обусловлен накоплением свободных радикалов, а именно супероксидного аниона, образующегося в цикле лимонной кислоты в условиях гипергликемии, который способен активировать множество клеточных путей: образование конечных продуктов неферментного гликирования (КПНГ), протеинкиназу С и сосудистое воспаление, опосредованное ядерным фактором каппа В (NF-kB). Повреждающее действие образующихся КПНГ, взаимодействующих со специфическими рецепторами, вызывает в конечном итоге фенотипическое переключение СГМК на остеобластоподобный фенотип, посредством повышения экспрессии Runx2, который действует как первичный транскрипционный регулятор созревания остеобластов в кости, а также регулирует производство белков остеобластов в сосудистых гладкомышечных клетках [19]. Таким образом, полученные нами результаты можно связать с избыточным производством продуктов окисления, ведущих к прогрессированию клеточных повреждений в первую очередь в сосудистых клетках, приводя в итоге к органоспецифическому повреждению сердечно-сосудистой системы.

Ограничения исследования

Ограничением исследования является его дизайн – нерандомизированное одномоментное, количество набранных пациентов в основной группе неравноценное, не оценивалось влияние проводимой медикаментозной терапии на СК.

Анализ данных показал, что СД2 в сочетании с ХБП является независимым фактором риска увеличения СК. Полученные нами данные могут свидетельствовать о более выраженном изменении сосудистой стенки у больных СД2 на ПГ в сравнении с больными без СД на ПГ, что обусловлено не только развитием ВГПТ на фоне гиперфосфатемии и нарастания FGF23, но и развитием окислительного стресса в результате самоокисления глюкозы и повреждающего действия продуктов свободнорадикального окисления, что позволяет связать высокую сердечно-сосудистую летальность у больных СД2 на ПГ также и с ускоренным развитием СК. Собственных данных по окислительному стрессу в статье нет.

Источник финансирования. Исследование проведено за счет средств авторов.

Конфликт интересов. Недосугова Л.В. декларирует отсутствие явного и потенциального конфликта интересов, связанного с публикацией данной рукописи. Рукопись является частью диссертационной работы Арчаковой Т.В.

Участие авторов. Л.В. Недосугова – концепция и дизайн исследования, редактирование текста, интерпретация результатов, написание и утверждение итогового варианта текста рукописи, интерпретация результатов; Т.В. Арчакова – сбор и обработка материала, статистическая обработка результатов исследования, анализ данных, написание текста. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.